电化学发光免疫传感器检测癌胚抗原

本资料包含pdf文件1个，下载需要1积分

· 40 ·第 l5卷第 5期2013年 10月黄 山 学 院 学 报Journal of Huangshan UniversityVo1．15．NO．50ct．2013电化学发光免疫传感器检测癌胚抗原赵 易 r，姚 武(1．黄山市人民医院，安徽 黄山245000；2．黄山学院 化学化工学院，安徽 黄山245041)摘 要：以鲁米诺还原纳米银作为信号分子标记癌胚抗原(CEA)。结合具有良好生物相容性的纳米金，固定癌胚抗原抗体于金电极上，成功建立了用于检测人血清中CEA含量的电化学发光(ECL)免疫分析方法。利用该方法可在浓度为0．1-50ng·mL 的线性范围内稳定监测人血清中CEA的含量。检测限为 0．05ng·mL- 。将该电化学发光传感器应用于健康志愿者的血清中进行CEA的检测．结果令人满意。相对标准偏差小于7．2％，平均回收率为 97．2—102．9％，具有良好的稳定性和重现性。

关键词：癌胚抗原；纳米银；电化学发光；免疫传感器中图分类号：TH733；R730．21 文献标识码：A 文章编号：1672—447X(2013)05—0040—03癌胚抗 原 (Carcinoembryonic antigen，CEA)是一种广泛存在于细胞表面分子量约为 200kDa的糖蛋白，是目前国际公认的一种肿瘤标志物，也是最具特异性的癌胚蛋白之一。CEA在健康成人血清中的含量一般低于 4．6ng·mL～，但研究显示，CEA在多种癌症患者血清内含量明显升高。[1因此，CEA目前在临床上常被当作是最重要的肿瘤标志物之一
，主要用于结肠癌、乳腺癌、肺癌以及多种恶性肿瘤的鉴别诊断、病I青监测和疗效评价。嘲免疫分析法是基于抗原一抗体特异性反应的一种分析手段，在结合了如电化学[31、表面等离子体共振 、荧光15以及化学发光【同等高灵敏度检测技术后，可成为处理复杂样品体系的有效方法。目前，常用于检测 CEA的免疫分析方法主要包括有放射免疫分析法，同酶联免疫分析法，同荧光免疫分析法 和电化学发光免疫分析法(ECLIA)。㈣电化学发光免疫分析法是一种兼具了电化学发光检测的高灵敏度与免疫分析的高特异性的一种分析手段。近年来。大量出现的基于ECLIA优点而构建的电化学发光免疫传感器，因其检测背景低、无放射陛污染、及可控性强。已得到广泛的关注。

随着纳米技术的高速发展，越来越多的纳米粒子已广泛应用于ECL免疫传感器的构建，其中纳米金以其良好的生物相容性和对鲁米诺ECL体系的显著增强作用被大量使用。此外，纳米粒子对 ECL信号物质的富集和信号强度的放大作用也得到越来越多的体现。

本文中使用简便方法合成了鲁米诺还原纳米银用于标记癌胚抗原，再与癌胚抗原样品竞争性结合由纳米金固定于金电极之上的兔抗癌胚抗原抗体，最终建立了一种新型的竞争型ECL免疫传感器。所合成的鲁米诺还原纳米银由于表面富集大量鲁米诺分子，在适当的电压下 ，通过纳米金对鲁米诺ECL体系的极大增幅作用，展现出强大而稳定的ECL光信号。在有癌胚抗原样品存在的情况下，鲁米诺还原纳米银标记的癌胚抗原竞争性的与抗体结合，其结合的数量与癌胚抗原样品浓度呈反比，即所产生的ECL信号在一定范围内随着癌胚抗原样品浓度的增大而明显下降，以此原理建立该竞争收稿 日期：2013-06—19基金项目：安徽省 自然科学基金面上项目 (11040606M41)；安徽省教育厅 自然科学研究项目 (KJ2010B215)；安徽省教育厅教学研究项目(20100997)；黄山学院人才培养模式创新实验区项目(2010SYQ01)作者简介：赵易(1989一)，安徽黄山人，黄山市人民医院。研究方向为药物分析；姚武(1968一)，安徽黄山人，黄山学院化学化工学院教授，博士，研究方向为有机分析化学。

第5期 赵 易，等：电化学发光免疫传感器检测癌胚抗原 ．41.

型ECL免疫传感器。本文考察了该方法的准确度、精密度、线『生范围及检出限等指标，结果令人满意。

2 实验部分2．1 仪器与试剂BPCL一2一KIC型超微弱化学发光分析系统(中国科学院生物物理研究所，中国)；CHI660c电化学工作站；TECNA一1 10型透射电镜 (飞利浦公司，荷兰)；KQ218型超声波清洗器 (昆山超声仪器有限公司，中国)；三电极工作体系：金电极为工作电极，铂丝电极为对电极，参比电极为Ag／AgC1电极。

兔抗人癌胚抗原单克隆抗体和癌胚抗原(CEA)购自北京博奥森生物技术有限公司(中国)；牛血清白蛋白(BsA，北京鼎国生物技术有限责任公司，中国)；AgNO，(Aladdin公司，中国)；鲁米诺(sigma公司，美国)；氯金酸(国药集团化学试剂有限公司，中国)；其它试剂均为分析纯，所用水为二次去离子水。

2．2 一步法合成鲁米诺还原银纳米在剧烈的搅拌作用下，将3mL5mmol·L-1 AgYO，水溶液加入到装有由9mL无水乙醇和5mL蒸馏水组成 的混 合 溶液 的圆 底烧 瓶 中 ，随后 再 将0．5mL0．01mol·L- 鲁米诺溶液(溶于0．1mol·L1NaOH)迅速加入混合溶液中去。然后将烧瓶保持在室温剧烈搅拌下反应2h。等待混合溶液颜色由无色到淡黄色，再到深黄色即得到鲁米诺还原纳米银。

2．3 鲁米诺还原纳米银标记抗体的制备将25~,L含有 lmg·mL 癌胚抗原的PBS(0．010mol·L-I,pH7．4)加入到 lmL鲁米诺还原纳米银 (用0．1mol·L1NaOH将 pH调至 6．5)，随后在 37~C下旋转混合孵育30min。然后，加入 2501~L5％BSA，继续孵育5rain。将混合物在 12500rpm下离心 30min，除去上清液 。将离心管下方沉淀物重新溶解于250g,LPBS中。【 】2．4 竞争型免疫传感器的制备将金电极在金相砂纸上打磨后，用 o 悬浊液将电极抛光成镜面，依次于30％的硝酸溶液、无水乙醇和水中各超声 5min，于空气中晾干备用。

将处 理好 的金 电极 浸入含 有 5．Ommol·L1，3一丙二硫醇的乙醇溶液中，并在室温下孵育20h。

取出后用乙醇和蒸馏水冲洗后，在金电极表面得到富含巯基的自组装层。采用柠檬酸钠还原氯金酸方法制备 16nm的纳米金。I121将电极浸入所合成的纳米金溶液中，在4~C冰箱中放置过夜，取出后用蒸馏水洗净。随后，滴加 30p,L含有501．Lg·mLq癌胚抗原单克隆抗体的PBS(0．010mol·L～，pH7．4)到电极上，37~(2下孵育2h。再将 301．LL5％BSA溶液滴加到电极上封闭1h，以减少非特异性吸附，蒸馏水冲洗后，4~C备存待用。

2．5 免疫反应过程和电化学发光检测将制备的免疫传感器置于 201~L样品和 101~L鲁米诺还原纳米银标记的癌胚抗原的混合溶液孵育1．5h，以完成免疫竞争反应。

处理后的免疫传感器工作电极与铂对电极.

Ag／AgC1参比电极组成三电极体系，置于含有 1．5mmol·L～H2O2的PBS(0．050mol·L～，pH10．5)的检测池中。使用阶跃脉冲法在工作电极上处施加0．8V电压 (脉冲周期30s，脉冲时间 1s，初始脉冲电压0V)，测定电化学发光信号强度，所有样品均平行测定 5次 。

3 结果与讨论3．1 鲁米诺还原银纳米的 TEM 表征将所合成的鲁米诺还原纳米银分散于超纯水中在透射电子显微镜下检测其形态及粒径大小。如图1所示。可清楚的观察到经由一步法合成的鲁米诺还原纳米银形态基本上呈球形，分散均匀，平均粒径在 25nm左右。

图 1 鲁米诺还原纳米银的透射电镜图3．2 实验条件的优化3．2．1 孵育时间对传感器ECL的影响在 37~(3的条件下，考察了孵育0．5h，1．Oh，1．5h，2．Oh及2．5h时。免疫传感器的响应情况。当孵育时间达到 1．5h时，传感器信号强度基本不再改变，这表明电极表面固定的兔抗 CEA抗体与孵育液中的鲁米诺还原纳米银标记CEA之间的免疫反应基本达到饱和，故选择 1．5h为最佳免疫时间。

3．2．2 检测池中pH值和H o 浓度的优化对检测池中PBS缓冲液的pH值优化，观察该因素对传感器信号响应的影响。随着PBS缓冲液的pH升高，ECL信号强度也逐渐增加。当pill0．5时，发光信号达到最大 ，随后又开始下降，与文献报道一 致，f1】所以选择pill0．5作为最优条件。

H：o 的浓度是影响ECL强度的另一重要因· 42· 黄山学院学报 2013生素。ECL信号在 H：o：浓度为 1．5mmol·L1时达到最大，且随着H o 浓度的继续增加，发光信号却有显著减弱，且背景噪音明显增大，所以H o：浓度选择为 1．5mmol·L～。

3．3 传感器的响应特性在最优实验条件下。即pill0．5及 1．5mmol·L一H o (溶于 0．050molL PBS)作为共反应剂，37qC~育1．5h后进行测定。CEA在 0．1-50ng·mL1范围内呈现线性，随着CEA样品浓度的升高，ECL响应信号逐渐降低，当CEA浓度达到50ng·mL 时，ECL信号基本不再降低，表明已达到饱和。线性回归方程为 IE~=-52．87C+2988，相关系数为 0．9982，检测限为 0．05ng·mL～。

3．4 临床样品中的应用取3名健康成人血液，于4000r／min转速离心，取上清液以0．1molL叫的PBS~H7．4)溶液稀释至检测范围内，使用本文所建立的方法进行测定并同时进行加标回收实验。如表 1所示 ，测定结果表明 3份样品中 CEA含量均在正常值以内，加标回收率在 94．0-102．9％之间，RSD值在 2．9-7．2％之间，表示所构建的免疫传感器的准确度与精密度均可令人满意，可用于临床样品的检测。

表 1 临床样品检测结果4 结 论本文利用简单的一步法合成了鲁米诺还原纳米银用作标记 CEA使之成为ECL信号探针，并采用纳米金同时作为抗体固定手段和 ECL信号放大策略，产生了强大而稳定的ECL信号响应，构建了一 种新型的简单灵敏的竞争型 ECL免疫传感器。该免疫传感器已成功应用于人血清中 CEA的测定，结果显示出了令人满意的准确度和精密度。所使用的鲁米诺还原纳米银合成简单、成本低廉，且具有较好的ECL性能，可有望用于多种标记和免标记ECL生物传感器的构建，以扩大其临床使用范围，具有较为广阔的应用前景。

参考文献 ：lil]Shen GY，electrieWang H，Dengmunosensor forT，Sben GL，Yu RQ．A novel piezo—detection of carcinoembryonic antigen明．Talanta，2005，67(1)：217—220[2]Schneider J．Tumor markers in detection of lung cancer[J】．Adv.

Clin．Chem．，2006，42，1-4 I.

f3]Wu J，Yah F，Zhang XQ，Yan YT，Tang JH，Ju HX．Disposablereagenfless electrochemicalbiopolymedsol—gel membrane forseveral tumor markers[J1．Clinical1488.

nosensor array based on asimultaneous measurement ofChemistry，2008，54(9)：1481一[4]Dutra RF，Mendes RK，Lins da Silva V，Kubota LT．Surfacer for human cardiac troponin Tbased on serf-assembled monolayer [JJ．J Pharm．Biomed．Ana1．，2007，43(5)：1744—1750.

f5]Rowe CA，Scruggs SB，Feldstein MJ，Golden JP，Ligler FS．Anarray im—mnnosensor for simulataneous detections of clinical ana—lvtes『J1．Ana1．Chem．，1999，7l(2)：433—439.

f6]Yang MH，Kostov Y，Bruek HA，Rasooly A．Carbon nanotubeswith enhaneed chemildetection of staphylococcal enterotoxin B in food2008，80(22)：8532-8537.

f0r CCD—basedlJ】．Ana1．Chem．，[7]Mohammadnejad J，Rasaee MJ，Babaei MH，Paknejad M，HasanZM．Salouti M．Gandomkar M．Sadri K．Radioimmunotherapy ofMCF7 breast cancer cell line with l3ll—PR8l monoc]onal anti—body against MUC l：comparison of direct and indirect radioiodi—nation methods『J1．Hum．Antibodies，2010，19(1)：l5—25.

f8]Gui WJ， Jin MJ， Sun LF， Guo YR， Zhu GN． Residuesdetermination of carb0furan in vegetables based on sensitive time—resolved fluorescence immunoassay 『J1．Food A c．Immuno1．，2oo9，20(1)：49—56.

[9]Yuan JL，Wang GL，Majima K，Matsumoto K．Synthesis of a newterbium fluorescent chelate and its application to time—resolvedfluoroimmunoassay『J1．Aha1．Chem．，2001，73，l869—1876.

[10]Cheng YF，Yuan R，Chai YQ，Niu H，Cao YL，Liu HJ，Bai LJ，Yuan Y L． Highly sensitive luminol electrochemilimmunosensor based on ZnO nanoparticles and ducose oxidasedecorated graphene for cancer biomarker detection fJ]．AnalyticaChimica Acta．2012．745：137-142.

[11]He Y，Liu DQ，He xY，Cui H．One—pot synthesis of luminalfunctionalized silver nanoparticles with chemiluminescenceactivity for uhrasensitive DNA sensing 『J]．Chem．Comm．，2011，47：10692—10694.

【t21Ambrosi A，Casta?eda MT，KiUard Aj，Smyth MR，Alegret S，Merkoei A． Double —codified gol,t nanolabels for enhancedimmunoanalysis[J]．Anahical Chemistry．2007．79：5232—5240.

责任编辑 ：胡德明ElecIrOchemiluminescence Immunosensor for the Determination of Carcinoembryonic AntigenZhao Yi Yao WuAbstract： Electrochemiluminescence immunoassay for the determination of eareinoembryonic antigenfCEA)was created with nanosilver as the signal molecule labeled on CEA and with nanogold to fix anti—CEA on gold electrode．This method can be used to determine the content of CEA in human serum withina linear range of 0．1-50ng·mL with a LOD (1imit of detection)of 0．05ng·mL一．The electrochemilumines-cence immunosensor has been successfully applied in the determ ination of CEA in the serum of healthyvolunteers．The RSD has been lower than 7．2％ 。and the average recovery rate has been 97．2—102．9％ ，which shows the sensor s good stability and I producibi1ity.

Key words：ECL；nanosilver；CEA；immunosensor