GGBP蛋白修饰的表面等离子共振微创血糖检测仪

第 21卷 第 9期2013年 9月光学 精密工程Optics and Precision EngineeringVolJ 21 NO．9Sep．2O13文章编号 1004—924X(2013)09—2333—07GGBP蛋白修饰的表面等离子共振微创血糖检测仪栗大超 ，李国卿，张晶鑫，于海霞，徐可欣(天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津300072)摘要：根据基于微流控芯片的组织液透皮抽取系统设计了一种小型化微创人体血糖检测仪器。该仪器基于微创的方法，利用真空负压抽取人体组织 液，并采用表面等离子共振 (SPR)技 术 ，通过检测皮肤真皮层组织 液 中的葡 萄糖 浓度来预测血液中的葡萄糖浓度。通过绑定对葡萄糖具有特异性吸附的【)I半乳糖／D葡萄糖结合蛋白(D-GGBP)，对 SPR传感器表面进行预处理 ，实现对葡萄糖分子 的特异性吸附 。实验配制 了不 同浓度 的葡萄糖溶液 ，检测并得出葡萄糖溶液浓度 与折射率的关系曲线。应用课题组设计的微创血糖检测仪，实验测量了葡萄糖溶液浓度与组织液浓度，并与血糖仪测量得到的葡萄糖溶液浓度进行了比较。结果表明，使用 GGBP修饰过的表面等离子共振传感器测量葡萄糖水溶液浓度的下限为 0．625 mg／dI ，当葡萄糖水溶液浓度在 0．625～5 mg／dI 时有较好的线性。通过测试实验验证了该仪器的可行性，显示 了结合 GGBP蛋白的 SPR测量技术 在微创血 糖检测领域有 良好应用前景 。

关 键 词 ：血糖检测仪 ；表 面等 离子共振 ；D-半乳糖／I)_葡萄糖结合蛋 白(GGBP)；组织液 ；微创中图分 类号 ：TH773：R318 文献标识码 ：A doi：10．3788／OPE．20l：32109．2333M inimally—invasive blood glucose detection instrumentbased on surface plasmon resonance sensor decorated with GGBPLI Da—chao ，LI Guo—qing，ZHANG Jing—xin，YU Hai—xia，XU Ke—xin(State Key Laboratory of Precision Med~uring Technology and Instrument，Tianjin University，Tianjin 300072，China)*C0 r】 Ps o 行g author，E-mail：dch li###tju．edu．cnAbstract：A portable minimally—invasive human blood glucose detection instrument was designed by amicrofluidic chip based interstitial fluid transdermal extraction system．On the basis of the minimally—invasive method，the instrument utilizes a vacuum pressure to extract the interstitial fluid from humanbody，adopts the Surface Plasmon Resonance(SPR)technology to measure the glucose concentrationof the interstitial fluid，and then predicts the blood glucose concentration with the glucose concentra—tion of the interstitial fluid．Moreover，by immobilizing D—galactose／D—glucose Binding Protein (175GGBP)which has a specific adsorption function to the glucose，it preproeesses the surface of the SPRsensor and realizes the specific adsorption of glucose molecules．In the experiment，the glucose solu一收稿 日期 ：2013-04—12：修订 日期 ：2013—04—22.

基金项 目：国家 自然科学基金 资助项 目(No．61176107，No．11204210，No．51350110233)；国家 863高技术研究 发展计划资助项 目(No．2012AA022602)；天津市科技支撑计划重点资助项 目(No．1IZCKFSY01500)；国家公益性行业科研专项 资金重点 资助项 目(No．GYHY2009060371)光学 精密工程 第2l卷tion with different concentrations was prepared and detected．According to the experimental resuhs，the curve illustrating the relationship between glucose concentration and refractive index was ot)一tained．In addition，the glucose solution and interstitial fluid were measured by using minimaly inva—sive blood glucose detection instrument designed by our research group．The test result was comparedwith that measured by a glucose meter．The experimental result indicates that the glucose detectionresolution could reach 0．625 mg／dI using the SPR sensor decorated with the GGBP．It shows a goodlinearity when the glucose concentration ranges from 0．625 mg／dL to 5 mg／dI ．The experiment veri—fies the feasibility of the instrument，and demonstrates that the SPR technology with immobilized GGBP will obtain a wide application in the field of minimally—invasive glucose measurement.

Key words：glucose detection instrument；surface plasmon resonance；D—galactose／D gluocose BindingProtein(GGBP)：interstitia1 fluid；minimally—invasion引 言糖尿病是中老年人的常见病和多发病 ，因此人体血糖浓度的连续、动态、精确检测是糖尿病预防和治疗的基础和前提_】J。当今，国际上人体血糖浓度检测方法主要包括有创血糖检测、无创血糖检测和微创血糖检测。其中，有创血糖检测方法即传统的指尖取血 ]，这种方法的缺点在于使病人受创较大，伤口易于感染，无法实现血糖浓度的连续 、动态检测，而基于光学光谱的无创血糖检测方法 尚处于研究阶段 ，且距临床应用还有较大距离[3]。因此微创血糖检测技术越来越成为研究热点 。

国内外 已有多个机构对微创血糖检测技术做了大量的分析与研究 。现阶段的微创血糖检测技术主要包括透过皮肤植入型检测技术 ]和组织液透皮抽取型检测技术Ⅲ5]。透过皮肤植入型的特点是将微型葡萄糖传感器植人体 内，通过检测组织液中的葡萄糖浓度来实现血糖检测。组织液透皮抽取型的特点是通过物理化学方法破坏皮肤角质层的结构 ，增大皮肤通透性 ，进而透皮抽取并检测组织液中的葡萄糖浓度 ，最终实现血糖检测 。本课题组对组织液透皮抽取型检测方法做了相关研究 ，设计并制作 了基于微流控芯片的组织液透皮抽取系统[6J。该系统主要可以实现组织液透皮抽取 、收集 、定量功能。

在基于微流控芯片的组织液透皮抽取系统的基础上，本文设计 了一种小型化的微创血糖检测仪器，该仪器在真空环境下抽取人体组织液，基于表面等离子共振l_7]葡萄糖浓度测量技术，通过在SPR传感器表面绑定对 葡萄糖具有特 异性 吸附的 D一半乳糖／D一葡萄糖结合蛋 白(D—galactose／Dglucose Binding Protein，GGBP)E8]，分析组 织液中的葡萄糖浓度，并最终对人体血糖浓度做出预测 。该仪器主要包括组织液提取部分、SPR检测部分、液体输送管道 以及 电路控制部分等。在整个工作过程中设计 完成 了微创血糖检测仪 ，进行了 GGBP蛋白绑定以及葡萄糖浓度测量实验 ，不需抽取患者血样 ，无痛、无感染风险 ，快速、准确地得到了检测结果 ，并 可实现 24 h连续 临控 ，满 足了动态、连续、精确检测血糖的需求。

2 SPR血糖检 测仪 器工作原理本仪器主要采用 TI公 司生产 的 Spreeta表面等离子共振生物传感器lg]。利用表面等离子共振技术测量葡萄糖溶液浓度的原理为：入射光在玻璃与金膜交界处发 生全内反射时 ，产生倏逝波K。，使得金属表面的 自由电子被激发而产生表面等离子波 K? 当入射 角或波 长满足一 定 条件时，表面等离子波与倏逝波的频率和波数相等，两者发生共振 ，入射光被吸收，使反射光能量急剧降低，在反射光谱上出现共振峰(反射强度最小值)。

不同浓度的葡萄糖溶液对应紧靠在金属薄膜表面的不同折射率 ，其共振 峰位置将不 同。我们根据不同的折射率推算 出不同的葡萄糖溶液浓度，进而达到能够测量不同浓度葡萄糖溶液的目的。该 9 j9】 栗大超，等：GGBP蛋白修饰的表面等离子共振微创血糖检测仪 2335仪器的检测原理如图 1所示 。

I矧 1 SPR血糖测 量原理Fig．1 l'heory of SPR blood glucose measurement如图 1所 ，A 是棱镜 ，B是金属薄膜 ，C是自组装分子层 ．与 B生成 Au—S键 的连接．C的另一 端 I)同定 了与待测物质有很强亲和力 的蛋 白质，E是葡萄糖 ．被 I)吸附 。本仪器利用 表面等离子共振测量方法，通过测量组织液 中葡萄糖的折射率来问接地推算 出葡萄糖的浓度，然而组织液的提取量是微量的，『夭l此需 要通过缓冲液的稀释以利于提取。由于组织液和缓冲液的混合液中不仅禽有葡萄糖，同时还含有 其它对溶液的折射率有影响的物质，所 以通过在 SPR传感器表面绑定埘葡萄糖具有特异性 吸附 的 GGBP蛋 白，来准确测量组织液 中的葡 萄糖 含量_l”j。实验 中所应用的 (；GBP是通过采用埃 希氏大肠杆菌 中的染合体片断构造而成 ，再由 PCR技术使其数量不断扩大 ，最后从大肠杆菌 中分离出来。GGBP与葡萄糖作用的位点是 可以控制的 ，本实验 中采用的GGBP是在 El 49C上定点突变【J 】。

3 SPR微创血糖仪 器设计量以及组织液提取 、输送与测量等功能 ，SPR仪器结构示意图如同 2所示 ，系统包括组织液抽取单元 、SPR传感器单 元、液体流通分配单元、电路控制单元等。

通夫 e丫图 2 SPR微创 血糖仪器结构示意 简图Fig．2 Structure diagram of SPR mini—invasive bloodglucose instrument系统 南微型真空泵和电磁阀配合工作产生不同的真空度 ，在负压下实现组织液的抽取 和检测液体流动 ，实现我们测量需要 的流速 20／,I ／min和 200“I ／min。能实现最大 65 kPa的负压．并由主机盒 内的压力传感器芯片检测整个系统的压力值 ，实现系统压力的反馈控制。

系统 中由六通 阀来实现液体 的分配控制，六通阀南步进电机带动控制，并配置零位检测系统。

六通阀可工作在 7种状 态下 ，通过联通六通 阀中的通道 ，可以在不同的时刻达到向 SPR中输送不同试剂以及达到真空抽取组织液的目的。六通阀7种状态下 的阀位如图 3所示 (数字序号代表阀的rI二位)。

CBIACPBD CPB5A2AD CP BD CP B6A3AD CPBDCPB0A4A图 3 六通阀阀位Fig．3 Valve position of six valveDPDP3．1 仪器结构本套仪器主要通过组织液透皮提取 ，SPR检 位 1：缓冲液标定：用于在测量开始前的一段测以及液体输送 等环节实现了葡萄糖溶液浓度测 时问获得平稳的缓 冲液折射率参考值。

光学 精密工程 第21卷位 2：预抽真空：用于抽 去抽取腔 中的空气，使抽取腔能够附着在皮肤表面。

位 3：预充缓冲液：向抽取腔中定量通入缓 冲液 1 mI 。

位 4：抽取 真空：使抽取腔真空，并维持 3 min左 右 。

位 5：检测：开始测量 ，组织液通入 SPR中进行测量。

位 6：排除清洗液 ：用于排除抽取腔中的用于清洗 的液体。

位 0：停止 ：各个通道断开。

3．2 仪器测量过程基于微创 IfⅡ糖检测仪，我们进行 了组织液中葡萄糖浓度的测量实验。仪器测量过程包括仪器初始化 ，缓冲液标定 ，蛋白绑定 ，组织液测量 ，仪器维护以及清洗等。测量的具体步骤为：(1)仪器预热 ，系统 中的各个泵 阀进 入初 始位置 。

(2)通入缓冲液到 SPR中，对 SPR进行标定和初始化，并获得测量的基准。

(3)步进电机置：f阀位 2，抽取真空到压力 2。

(4)利用定量泵 向抽取 腔中充人 1 mI 的缓冲液。缓冲液的数量应该保证在真空抽取组织液时能够完全覆盖皮肤表面。

(5)对抽取腔 中抽真空 ，计 时 3 min，将组织液通入 SPR中，开始对组织液进行测量 ，组织液的测量时间为 4 min，流速为 lO『』I ／min。

(6)通人缓冲液到 SPR．冲走传感器表面吸附的葡萄糖，时间为 2O s，流速 200 I ／min。并同时计算浓度值．显示并保存。

(7)将剩余的组织液排除干净。

(8)通过维护盒的自动识别进入维护、标定或是绑定过程。

3．3 仪器实物仪器小型化系统实物如图 4所示 ，测量时，首先对被测者腕部皮肤作超声预处理，以提高皮肤的通透性 ，便于组织液的抽取，然后将仪器佩戴在腕处，手臂平放 ，如图 4(a)所示 ，通过腕带传感器模块上的按键进行操作。腕带传感器模块的内部结构如图 4(b)。进行绑定或维护操作时 ，通过管道将腕带传感器模块和试剂盒模块连接 ，也是通过腕带传感器模块上的按键进行操作 。

(a)腕式模块(a)Wrist module(b)腕式模块内部图(b)lntemal structure diagram图 1 SPR测量仪器实物罔4 SPR 微 创 血 糖 仪 器 实验 过 程 及结 果开发出实验样机后 ，进行了 GGBP蛋白胺耦合绑定实验 ，并利用绑定好 (；(}BP的传感器测量了不同浓度的葡萄糖溶液，得到溶液浓度与折射率之间的关 系。最后 ，应用于组织液巾葡萄糖浓度的测量 ，并与已知浓度 的葡萄糖水溶液以及使用同定化酶膜传感器测量 所得 到的参 考值进行比对 。

4．I GGBP绑定蛋白实验本实验所使用的 T1公司生产的 SPR传感器的尺寸为 14 mm×29 mmx 41 nlm。传感器是基于微系统技术制造 的，在极小 的空间内集成 』 3个共阳极的 I ED光源(波长为 840 nm)、起偏器 、棱镜、金膜(厚度为 50 nm)、反射镜 、以及 3个 1 28像元的线阵二极管光强检测器 !】。其分辨率为 5×10一RU。传感器内部及外部结构示意冈如 5所示 。

(a)传感器内部结构图 (b)SPR传感器外部示意图{a)lntemal structure of sensor (b)Extemal structure of sensor罔 5 SPR传感器结构Fig．5 Structuref SPR sensor本实验 首先在 SPR传感器表面绑 定 ( ( I3P蛋白，实现对葡萄糖分子的特异性吸附 ．金膜表面处理和绑定 GGBP蛋 白的主要步骤是 ：(1)在对金膜表面进行清洁处理后 ．通入含羟第9期 栗大超，等：GGBP蛋白修饰的表面等离子共振微创血糖检测仪基的溶液 ，使得在金膜表面生成 Au—S键 的自组装分子层 。

(2)通人缓冲液洗去多余的羟基溶液，再通入表面活性剂 ，通 常为 NHS／EDC的混合物 ，EDC与 NHS反应后 ，可产生 NHS活性 酯。NHS活性酯可以与蛋 白质 N端上 的氨基 以及赖氨酸残基上的氨基发生缩合反应产生氨基化合物，从而形成共价键连接。

(3)通人待 固定在金膜表面的配体 ，而后观察SPR曲线的趋势 ，直至 SPR曲线不再变化 ，说 明此时的金膜表面已经达到了所能吸附的配体的最大量 。

(4)通人 PDEA或乙醇胺等胺类的物质，这些物质主要是封闭那些没有与配体作用形成共价键的部位，再通人缓冲液洗去多余的 PDEA或乙醇胺 。

(5)传感器表面的预处理已全部完成 ，此时即可通入待检测的溶液。

本实验中采用的是胺耦合绑定方法 ，绑定过程中折射率随时间变化曲线如图 6所示。

图 6 SPR传感器表面折射率变化图Fig．6 SPR sensor surface refractive index profile4．2 测量葡萄糖溶液实验结果实验中配置不同浓度 的葡萄糖水溶 液，在室温 28℃下，在表面绑定 了 GGBP蛋 白后 的 SPR传感器上进行实验。实验用水以及配制葡萄糖溶液 的溶剂都 为去离 子水 ，溶质为分析纯 葡萄糖 。

对不同浓度葡萄糖溶液的替换都需要通人去离子水清洗管道，用以获得稳定的折射率参考曲线。

实验结果如图 7所示 ，当 SPR仪器测量浓度较低的葡萄糖溶液时 ，有较好 的线性测量结果 ，当测量浓度较高的葡萄糖溶液时，线性变差，但测量得到的折射率随溶液浓度的增大而增大 。当葡萄糖溶液的浓度在 0．625～5 mg／dL时有较好 的线性 ，其分辨率已经能够满足稀释后的组织液的测量需求 。

： ■B 10．625 1．25 2．5 5Glucose concen~mmn／(mg’dL一 、图 7 葡萄糖溶液浓度测量曲线Fig．7 Measuring curve of glucose concentration4．3 组织液测量结果利用低频超声对皮肤进行预处理 ，增加皮肤的通透性 ，然后通过真空负压抽取组织液。现在医学研究已经证明了组织液 中和血液中葡萄含量的一致性，只是由于细胞的渗透作用，也许会有10～15 min的延时。

人体正常 的空腹血糖 浓度 为 80～ 120 mg／dL，餐后 2 h的血糖浓度大于 140 mg／dL即为糖尿病。由于抽取 的组织液量很小 ，约 1／,L，所 以需要利用磷酸盐缓 冲液进行稀释。稀释 10倍后的组织液通过 SPR仪器测量其葡萄糖浓度值为l3～15 mg／dL，将其与已知浓度的葡萄糖水溶液进行 比较 ，如图 8所示。使用 内置固定化酶膜传感器的血糖仪测量获得参考值，并对两者进行比较 ，对比的结果如表 1所示。通过对比显示，实验结果达到了预期效果 。

．25o．2． 15O．1．O500．1 g 组织液l组织液2组织液3组织液4 O-2 gDiluent interstitial fluid图8 绑定蛋白测量组织液中葡萄糖浓度Fig．8 Measurement of interstitial fluid glucoseconcentration by binding protein叭 ∞ ∞ 0∞ 加 ∞ ∞ ∞ ∞lI2 aⅡID Dll1 Al 譬 ^I抛 珊 Ⅲg lI— 一岂舟JI兰 p． g一／【10一葛_Ilu8一—IoQ ∞0。Il02338 光学 精密工程 第21卷表 lTab．1血糖仪与 SPR仪器测量组 织液葡萄糖浓度对 比Comparison of interstitial fluid glucose eoncentrations measured by a glucose meter and SPR5 结 论本文研究 了基于表 面等离子共振 技术 的微参考文献 ：[1] 许曼音，陆广华．糖尿病学[M]．上海：上海科学技术 版社 ，2004：189.

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YU H X． Interstitial fluid transdermal ea：tractionmethod & systematic research based on PDMS mi一创血糖检测仪器 ，设计 了一 种新型 的小型化 微创人体血糖检测仪器，在 SPR传感器表面绑定了 GGBP蛋 白，并应 用微创 血糖检测 仪测量 了葡萄糖水溶液浓 度和组 织液 葡萄糖浓 度 ，获得了 良好 的实验 结果 。实验结 果表 明，使用 对葡萄糖有特异性 吸附 的 D一半乳糖／T)_葡萄糖 结合蛋 白(GGBP)修饰过的表 面等离 子共振传感 器，测量葡萄糖水溶液 的下 限为 0．625 mg／dI 。当葡萄糖水溶液 浓度在 0．625～5 mg／dI 时有较好的线性 ，验证了本 套仪器 的可行性 ，显示 了结合 GGBP蛋 白的 SPR测量技术在微创血糖检测领域的良好应用前 景。下一步 的工作 是研 究组织液的定量抽取，提高仪器的分析精度，并建立组织液 中葡萄糖浓度和血糖浓度的关系。

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群9期 栗大超，等：GGBP蛋白修饰的表面等离子共振微创血糖检测仪 2339者简 介栗大超 (1 976一 )，男 ，河 南南 阳 人 ，博士 ，副教授 ，硕士 生导师 ，2001年、2004年于天津大学 分别获得 硕 士和博 士学位 ，2004～2006年 在北 京 大学 微 电子学研究院“微米／纳米加 1一技术国家重点实验窀”从事博士后研究一r作，2006～ 2008年于 美 国 CwRU 大学 电 子T程系从事博十后研究_1 作，主要从事微系统 技 术 与微 型 仪 器 、生 物 医学 检测 技术 、精 密测 试技 术 及 仪 器 等领 域的研究 。E—mail：dchli###tju．edu．cn李 国卿(1 988一)，男 ，天津 人．硕士研究生 ，2O1 1年于天津 大学获得学 士学 位 ，主要从 事血液 与组织液 的生 理延 迟模型 血糖 连续 监测 中的 应用研 究 。E—mail：liguoqing###tju．edu．cn张晶鑫 (1 986一)，女 ，河北 张家 口人 ，硕士研究 生 ，2O10年于 天 津大 学 获得 硕士学位，主要从事微创血糖表面等离子 共 振 葡 萄 糖 检 测 研 究 。E—mail：herbs### 1 26．com于海 霞 (1 980一)，女 。河北 唐 山人 ，博士 ，2007年 、2011年于天津大学分刖 获得硕士 、博士学 位 ，目前在 天津大 学精密仪 器与光 电子 T程学 院进行博 士后研究T 作 ，主 要从 事 微创 血糖监 测 方法 的 研 究 。 E—mail： jyyhx2000###】63．com徐可 欣 (1 956一)，男 ，安徽 颖 上 人 ，博士 ，教授 ，博士生导师 ，1 985年 、I988年于天津大学 分别 获得硕 士、博 士学 位 ，主要从事采 用光谱 方法进 行人体 微弱成分无 创伤 检 测方 法 的研 究 、生 物 光学及微弱化 学成 分智能化 检测方 法 的研究 。E—mail：kexin###tju．edu．cn& 日