电子目镜显微镜景深的确定与测量

显微镜是观察微小物体或物体的微细部分时不可缺少的工具，根据图像获燃术的不同，它可以分为传统的目视显微镜以及现代的数码显微系统1]。带电子 目镜 的光学显微镜 (简称 电子 目镜显微镜)是-种现代 的数码显微系统，它用电子 目镜替换了传统目镜，物镜对观察物成的放大实像位于目镜的物方焦距外，目镜对此放大像成实像于cM0S(或 CcD，本文以 CMOS为例)图像传感器上。CMOS芯片内集成了 A/D转换器，可以方便地将采集到的图像信息传输到计算机终端l2]。与传统 目镜相 比，电子 目镜使得观察过程更加方便简单。景深 (DOF)是显微 系统的重要技术参数之-，在传统的计算与分析中，数码显微系统的总景深通常由几何景深和物理景深两项相加组成 ]，但 没有文献对 其原 因给 出明确 的解释，因此近年来有研究者对此观点提出质疑[7 ]。

本文认为 ，总景深等于几何景深与物理景深之和的观点是有待商榷的。因此本文从景深的基本概念出发，较为深入地分析了数码显微系统的几何景深以及物理景深 ，并提出几何景深与物理景深间的关系是-种数学上的相或”关 系。根据这个观点 ，推导出了数码显微系统的景深满足的数学形式，最后通过毛细管成像实验验证了所导出景深公式的正确性 。

2 传统景深公式任何光能接收器 ，例如眼睛、感光乳剂等的分辨率都是有限的，所以像平面上的像点不-定为- 几何点 ，而是根据接收器 的特性规定-个允许的数值∮收器所在的平面称为景像平面，在物空间与景像平面相共轭的平面称为对准平面 。能成清晰像 的最近 的物平面称为近景平面，近景平面与对准平面间的距离称为前景深 ；能成清晰像的最远的物平面称为远景平面，远景平面与对准平面间的距离称为后景深 ；近景平 面与远景平面之间的距离称为景深 ]。

当显微系统聚焦于对准平面时，通过物镜所成的-次像位于 中间像 面上 ，当物点位于对准平面之前或之后时 ，-次像也将位于中间像面之前或之后 ，相应的在接收器上所获得的图像就不再是-个几何点，而是-个弥散斑。当弥散斑的尺寸小于接收器的极限分辨距离时，所获得的像看起来仍然是清晰的，相应的物平面离开对准平面的距离就定义为几何景深 ，其计算公式为[1 ：ds- ， ( )其中：n为物方空间折射率，e为探测器 的极 限分辨距离 ，M 为显微系统的横向放大率 ，NA为物镜的数值孔径 。

由于存在衍射效应，点物经透镜成像后不再是-个点像，而是形成-个三维的光能分布 ，垂直于光轴的像平面上光能分布是-个贝塞尔函数，其中心亮斑称为艾里斑 ，沿 光轴方 向的光能分布是-个 sinc函数 。显然 ，当接收器沿光轴方向移动时 ，接收器上的光强分布是不同的，-般认为光强变化在 2O%以内时是难 以区分 的。相应的点物移动的距离就定义为物理景深，其计算公式为 ：d - nA， (2)其中： 为光波的波长。在传统分析中，数码显微镜 的总 景 深 是 几 何 景 深 与物 理 景 深 之和C3-6，即 ：dt。t- ds - e . (3)3 电子 目镜显微镜景深公式的推导3.1 电子 目镜显微镜的成像光路电子 目镜显微镜主要 由显微物镜和电子 目镜两部分组成。显微物镜 由-组透镜组成 ，本文将它简化为- 片薄透镜 L 。电子 目镜包括光学成像系统及电子处理系统两部分，光学成像系统可简化为-片薄透 镜 L ；电子处理 系统则主要 由CMOS图像传感器组成 ，它可以将光学 系统得到的图像进-步放大。电子目镜显微镜的成像光路如图1所示，被观测物体 AB经物镜L 成像后在其共轭面形成-个倒立放大的实像 A B ，A B 位于透 镜 L 的焦 距 以 外，经 透 镜 L 成 像 后 在CMOS图像传感器上形成-个倒立的实像 B 。

通常情况下 ，L 对 A B 起到缩小 的作用 ，L ，L。构第 5期 孙丽存 ，等：电子 目镜显微镜景深的确定与测量成电子目镜显微镜的光学成像系统，横向放大率分别记为 ， 。

J f 喙. ；， // / ” ： l/- 日图 1 电子 目镜显微镜 的成像光路 图Fig.1 Optical path for microscope equipped withelectronic ocular3.2 几何景深公式推导图 2为电子 目镜显微镜 的几何景深原理 图。

图中，1为显微物镜 的对准平面 ，经过 L 、L。的共轭面分别为 1 、1”，l 为景像平面 ，也就是 CMOS图像传感器所在的平面。当物点位于对准平面上时，它的像点位于 CMOS阵面上～物点向前平移至平面 2时 ，其像点在共轭平 面 2”，在 CMOS平面上则形成弥散斑。当弥散斑的尺寸 e刚好等于 CM0S的极限分辨距离时，平面 1与平面 2之间的距离 ，即 s 与 s。的差值称为该 系统的前景深 ，用 表示 。设 电子 目镜显微镜的物方空间折射率为 ，2，像方空间折射率为 1。

厶 ：图 2 几何景深原理 图Fig.2 Principle of geometric DOF由几何关系得出 ： 鲁- ≈ ，㈤ -7 7所 以 ：- 。

在 L。的物空间对应 的轴 向距离为：，- ：：： ，其中 - -f 8 11。，为L 的轴向放大率。

由几何关系还可得出 ：D2-D1- 联立式(5)、(6)、(7)可解得 ：· - ·同理可得 ：8sg1- - (9)其 中：D 为显微物镜孔径光 阑的直径 ，当光轴上位于对准平面的物点发出的光可 以覆盖整个显微物镜镜头时，显微物镜的 NA为 z] sin ≈ ，1设电子 目镜显微镜光学 系统 的放 大倍数 为 M，即M- ，则式(9)可写为 ：s1- -2M NA . (1O)电子 目镜显微镜 的后景深与前景深 的推导过程-致 ，可近似认为后 景深与前景深相等 ，因此 电子 目镜显微镜的几何景深可写为 ：- 2 - . (11)式(11)与式(1)完全相同。当入射光线没有照) ) ) ) 5 6 7 S 光学 精密工程 第21卷满整个显微物镜的镜头时，式(11)中的 NA应替换为显微物镜的有效数值孔径[13-14 (NA) ，即：s- · (12)根据尼奎斯特定理口 ，CMOS图像传感器的最大可分辨空间频率等于其空间采样频率的-半。

设 CMOS的基本像元尺寸为 b，则 CMOS图像传感器能够分辨的最朽离应该等于其像元尺寸的两倍 ，即式 (12)中的极限分辨距离 8-2b。

3.3 物理景深公式推导如图 3所示 ，由于衍射效应 ，位于对准平面 1轴上的点物 A经透镜L 后在中间平面 1 形成艾利斑 A ，A 经透镜 L。后在景象平面 1”(CMOS平面)仍然是-个艾利斑 A”。当点物 A 向左移动至 A点时 ，A 在平 面 1 上形 成-个 弥散”的艾利斑A 。按物理 景深 的定义 ，当这个 弥 散”艾 利斑A 的光强下降到艾利斑 A”光强的 8O 时，A 与A之间的距离就是电子 目镜显微镜的物理景深(后景深)。物理景深的严格计算需要用物理光学的方法 ，而本文采用-种简化方法来推导电子 目镜显微镜的物理景深。

J>< 图 3 物理景深原理 图Fig.3 Principle of physical DOF点物 A 沿光轴向左边移动至A 点的效果 ，等同于 A点在对准平面 1上离轴扩展为-Az-A3，A。为-A2-A3 中点。-NAW X～；等于显微物镜 L 的分辨率时，-A2-A3端点 A ，A。的共轭点 A ，A 。与 A。的共轭点 A 。刚好可以分辨。此时，相应的A 与 A之间的距离即为显微系统 的物理景深(后景深 ，用表示)，如图 3所示。显微系统能分辨的物方两点间最短距离为 ]：- . (13) 口 - l5 J相应 的，在 CMOS平面上的最小分辨距离为 ：a - M . (14) l J由几何关系可得 ：- ≈ 业 ≈NA/ . (15) 8s口1 sl D1 S1 所 以 ：- - . (16)其前景深与后景深的推导过程类似 ，在近似条件下与后景深相等，因此电子目镜显微镜的物理景深 可写 为 ：8s - 2 - . (17)当物点发出的光不能覆盖整个显微物镜 的镜头时，其物理景深为 ：- . (18)将艾里斑的直径 2n看作 由衍射效应所决定的CMOS的极限分辨距 离，代替式 (12)中的 e值 ，得到的结果与式 (18)相同。

3.4 电子 目镜显微镜的总景深由上述 推导 过 程 可 见 ，轴 上 物 点 经 电子 目镜 显微镜成像 在景像平面上 后 ，弥散 斑”和艾里斑”在空间是相 互重叠 而并非 相互连 接 的，在物空间与弥散斑 ”对 应 的几何 景 深 和与艾里斑”对应 的物 理景 深也 应 该是 相 互重 叠 的 。因此 ，电子 目镜 显微 镜 的总 景深 与 几何 景 深 以及物理景深之 间的关 系是-种 数学上 的相 或”关系而非求 和”关 系。当物 镜 的 NA 较 小 时 ，衍第5期 孙丽存，等：电子目镜显微镜景深的确定与测量射效应突 出，景像平 面上艾里 斑”的直径 2n大于 CMOS的极 限分辨距 离 P-26，物理景深起 主导作 用 ，电子 目镜 显微 镜 的总 景深 由式 (18)确定 ；当物镜 的 NA较 大时 ，景像平 面上 艾里 斑”的直径 2a小 于 CMOS的极 限分 辨距 离 e-26，几何景深 起 主导 作 用 ，电子 目镜 显 微镜 的总 景深 由式 (1 2)确 定 。换 言 之 ，电子 目镜显 微 镜 的景深应为几何景深与物理景深中的较大值。因此 ，总的景深等 于 几何 景 深 与物 理 景 深之 和 ”的提法 是不 妥 当 的。根 据 以上 分 析 ，得 出电子目镜读数显微 系统的总景深公式为 ：f 1.22m 、 。

I丽 b- . (19)IM- (N-A )，af。 r b4 实验验证为了验证电子 目镜显微镜的景深公式 ，本文设计 了如图 4所示 的测量装置。点光源经 准直后变成-束平行光，经过狭缝限宽后照射到注有液体 的玻璃毛细管上，经折射后形成-束具有-定张角 的会 聚 光 束，在 毛细 管 的焦 平 面 处 形成 - 条 亮线” 川。当该亮线”位于显微物镜的工作距离时，可在计算机 终端观察到-条最窄 的清 晰亮 线”。

实验时 ，精密位移平 台的调节精度为 1 m。观察到的图像从模糊变为清晰 ，又从清晰变为模糊 ，图像刚好清晰时位移平台读数 (记为 d )与到图像刚好模糊时位移平台读数(记为 d )的差值 即为电子目镜显微镜的景深。

M icroscope with图 4 测 量装 置图Fig.4 Schematic of measuring setup平行光经注有液体的毛细管折射后所形成的光束半角宽的正弦值为 ：- h- hsin ～RnLo， (20) - 十 -- zuJ式中：R，r， 。分别代表毛细管的外半径、内半径以及折射率 ， 代表注入液体的折射率，h代表缝宽。

调整 h或 的数值 ，可以方便地改变光束的半角宽。 由图4可以看出，当亮线”发出的光完全覆盖镜筒时 ，物镜的镜筒外壳决定 了显微物镜的孔径光阑，并确定了电子 目镜显微镜的(NA) (即显微物镜数值孔径的标称值)；当光斑没有盖满镜筒时，光束张角 的大婿定了显微物镜的有效孔径光阑，并确定了电子目镜显微镜的(NA) 。

所以电子 目镜显微镜 的(NA) 为 ：(NA) - in ， in≤NA . (21) iNA，s 测量装置中的显微物镜与电子 目镜可以方便地更换 ，同-个电子 目镜经过软件处理后还可具有不同的分辨率 ，同时狭缝的宽度 以及注入毛细管的液体种类都是很容易改变的。因此 ，毛细管成像系统是-个验证电子 目镜显微镜景深与(ⅣA) 及显微镜规格之间关系的行之有效的测量装置，也是-个验证显微系统的景深与其几何景深 、物理景深之间关系的行之有效的测量装置。

测量过程 中，单色光 -0.58 m；毛细管 R-1.534 3 mm，r-1.106 3 mm， 0-1.516；显微物镜为 10×(NA-0.25)，20×(NA0.4)两种 规格；电子 目镜为杭州荣耀科技有限公 司生产的型号G300UMD的 10×(P2-1/3)，20×(J32-2/3)两种规格的电子 目镜 ，两种 电子 目镜均有 640×480，1 024×768，2 048x 1 536三种分辨率 ，相应 的像元尺寸为 9.6 m×9.6 m，6.4 m×6.4 p.m，3.21156 光学 精密工程 第2l卷m×3.2 m，相应的 e值大小为 19.2，12.8，6.4m 。

表 1列出了 显微 物镜 为 2O× ，电子 目镜 为10×时，在不同液体 、不同缝宽、不同分辨率下电子目镜显微镜的景深值。表 2列出了狭缝宽度 h-1.6 mm，毛细管 内注入液体 为喹啉 时 ，不同电子 目镜显微镜在不同分辨率下的景深值。

(NA) 是 由式 (21)计算 出的测量系统的有效 数值孔径 ；2口由式 (14)确定 ，2b由 电子 目镜 的分辨率确定 ；3s ， 分别是根据式 (12)、(18)计算出的显微 系统 的几何 景 深与 物理 景 深 ；测量 值d ，d。为多人多次测量的平均值； ± 代表电子目镜显微镜景深的测量值及其多次测量结果的标准偏差 。

表 1 有效数值孑L径不 同时 20×1O电子目镜显微镜 的景深Tab.1 D0F results for 20×10 microscope with different effective numerical apertures由表 1可看出，狭缝宽度以及毛细管中注入的液体折射率对电子 目镜显微镜的(NA) 都有较大的影响 ]，景深 的大小对于 (NA) 的变化非常敏感。在 (NA) 值 较小 时 (如 表 1中第 二行 ： -1.333 3，狭缝宽度 -0.8 mm，(NA)ef0.114)，2a(41.4 tm)>2b(19.2 tLm)，景深测量值 ( -56.8第 5期 孙丽存 ，等：电子 目镜显微镜景深的确定与测量m)接近物理景深值( -54.4 m)而非物理景深与几何 景深 ( -25.3 m)的和 ( -79.7 m)。在 (NA)ef值较 大时，如表 中第九行 ： ：1.622 1，狭缝宽 度 -1.6 mm，(NA)。f-0.40，2a(11.8 m)<2b(1 9.2 m)，景深 测量值 ( - 7.8 m)接 近 几 何 景 深 值 ( - 7.2m)，而非物理景深 ( - 4.4 m)与几 何景 深的和( -11.6 m)。表 中的其 它数据 也反映 了相 同的规 律 。

对于 2O×10的电子 目镜显 微镜 ，由式 (1 9)可 以算 出 ：若 电子 目镜 的分 辨 率 为 64O×480，当 0.246< (NA) ≤ 0.4时 ，2a< 2b(1 9.2m)，其景深 值 撒 于几 何 景深 的大小 ；当 0<(NA)ef<0.246时，2口>2b(1 9.2 m)，其景深值撒于物理景 深 的大小 。若 电子 目镜 的分辨率为 1 024×768，当 0.368< (NA) ≤0.4时 ，2a2b(12.8m)，其景 深值 撒于几何 景深 的大小 ；当 0< (NA)。H< 0.368时 ，2n> 2b(12.8m)，其 景深值撒于物理 景深的大小 。若 电子目镜的分 辨率 为 2 048×1 536，则在 整个 有 效数值孔径范 围 0< (NA) ≤0.4，景像 平面上艾里斑 ”的直径 2口均大 于 CMOS的极 限分 辨距离 2b(6.4m)，其景深值撒于物理景深的大小 。表 1中的数据与上述结论均相符 。

表 2 不 同规格 电子 目镜 显微镜的景深值Tab.2 D0F results for different microscopes1O× 2O× 0.25 18.219.212.86.411.57.73.820× 1O×19.212.86.47.24.82.49.080 49.O78 79.078 47.8± 0.74.8土 0.54.5± 0.620× 20× 0.40 22.819.212.86.43.62.41.2由表 2可看 出，当 CMOS的分辨率较高 (6值较小 ，口>6)时，电子 目镜显微镜的景深主要撒于其物理景深的大小，此时的景深值决定于显微物镜的NA，而与目镜的放大倍数无关。

电子 目镜显微镜的景深撒于其物理景深、几何景深中的较大值 ，而不等于两者之和。当物理景深较大时，电子 目镜显微镜的景深与光波波长成正 比，与(NA) 的平方成反比；当几何景深较大时，电子目镜显微镜的景深与 CMOS像元 的大小成正 比，与(NA) 成反 比，与光学成像 系统 的横 向放大率成反 比。

5 结 论本文研究 了电子 目镜显微镜 的景深与其物理景深和几何景深之间的关系 ，推导并验证了电子 目镜显微镜的景深撒于其物理景深和几何景深中的较大值 ，而不是传统观点认为的物理景深与几何景深之和。随着 图像传感技术 的日渐成熟 ，图像传感器的像元尺寸必将越来越小 ，因此可以预想电子目镜读数显微镜的景深大蝎主要由衍射极限决定 ，即景深值等于其物理景深。此时 ，电子 目镜显微镜 的景深与光波波长成正比，与(NA) 的平方成反 比。本文推导出的景深公式对电子 目镜显微镜的设计和合理使用具有重要的参考价值 。

5 3 4 1 1 1 士 ± ±8 4 9 2 1 1 1 1 1 0 1 7 1 O 0 9 9 9 6 6 6 9 9 9 2 7 8 8 8 8 卯 盯9 9 9 6 9 9 2 3 3 9 9 9 6 4 5 0 O O 土 ± -8 3 4 4 4 4 5 2 O 8 8 8 9 9 9 7 9 6 3 3 3 9 9 9 1158 光学 精密工程 第21卷