发酵综合实验

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发酵综合实验
发酵工程大实验
--乳酸分批发酵实验
-、 实验目的
1. 了解乳酸发酵常用的发酵菌种。
2. 掌握L-乳酸发酵的工艺控制过程和方法。
3. 能熟练运用发酵过程的基本原理，根据实验的不同要求，正确地设计实验方案，并按照实验方案进行实验研究。
二、 实验原理
分批操作又称间歇操作，指培养基灭菌、冷却后，接入微生物菌种，维持-定的反应条件进行反应。反应过程中不再加入反应基质，也不输出产物，只有等待反应进行到规定的程度后，才将全部发酵液放出的操作过程。
按发酵过程中生成产物的不同，可以将乳酸发酵分为同型和异型发酵，若产物仅为乳酸，则为同型发酵，若产物为乳酸、酒精、乙酸等，则为异型发酵。多数乳酸产生菌不耐酸，发酵时中和剂可采用碳酸钙、氢氧化钙、氨水、氢氧化钠等。
工业上，乳酸生产菌有德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、赖氏乳杆菌(Lactobacillus leichmannii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、米根霉(Rhizopus oryzae)等。
三、 材料与分析方法
1. 菌种：泡菜乳酸菌（每组-种菌）
2. 培养基
(1) 斜面培养基： PDA培养基。
(2) 种子培养基（g/dL）：葡萄糖8， （NH4）2SO2 0.4， 甘薯淀粉2，MgSO4•7HO2 0.025， ZnSO4•7HO2 0.044， KH2PO4 0.02， FeSO4 0.001， CaCO3 0.2，装液量：10ml/100ml三角瓶。
(3) 发酵培养基（g/dL）：甘薯淀粉15，（NH4）2SO2 0.4，MgSO4•7HO2.025， ZnSO4•7HO2 0.044，KH2PO4 0.03，100ml/500ml三角瓶，CaCO3 7 (分开灭菌)。
3. 分析方法
（1）pH：采用酸度计或pH试纸测定。
（2）乳酸定性测定：纸层析法。展开剂为水：苯甲醇：正丁醇1：5：5；显色剂为0.04%的溴酚蓝酒精溶液，用0.1M的氢氧化钠调节pH到6.7。
（3）乳酸定量测定：EDTA定钙法。
生物量的测定：干重法～菌丝体过滤，用稀盐酸或去离子水洗2～3次后，置60-80℃干燥箱至恒重。
（4）还原糖的测定：斐林试剂法。
（5）氨基氮的测定：参考《工业发酵分析》中的相关测定方法。
（6）乳酸的提取：50%硫酸酸解法。取预处理后发酵液，根据发酵液中钙离子的含量，按照钙离子与硫酸根1：1（摩尔比）的量加入50%硫酸直接酸解。
四、实验方法与步骤
1. 固体种子培养/斜面培养：32℃培养3天。
2. 液体种子培养：种子培养基经115℃灭菌20分钟后，接入孢子使得种子液的孢子浓度达到105-6个/ml，温度为32±1℃，以200rpm的转速于摇床培养18-24h。
3. 发酵培养：发酵培养基115℃灭菌20分钟后，按10%接种，以32℃、200rpm的转速置于摇储酵60-72h。CaCO3在第20h单独加入。
4. 米根霉发酵生产乳酸最佳条件：改变发酵的某-条件如碳源、碳源浓度、氮源、氮源浓度、种龄、温度、转速、装液量等，测定发酵周期，乳酸产量、产率，碳源利用率等，以确定该菌株的最佳发酵条件。
五、结果与分析
1. 该发酵菌种的生长特性，绘制菌种生长及代谢产物形成与培养时间的关系曲线。
2. 构建该菌株在最佳发酵条件下的细胞生长、底物利用和产物形成动力学模型。
3. 找出该菌株发酵生产乳酸的主要影响因素，确定其最佳发酵条件。

附录 （-） 还原糖的测定
1、试剂配制
（1）斐林氏甲乙液
甲液：称取分析纯硫酸铜35g，次甲基蓝0.05g，用蒸馏水溶解后稀释至1000mL。
乙液：称取分析纯酒石酸钾钠117g，分析纯氢氧化钠126.4g，分析纯亚铁氢化钾（黄血盐）9.4g，用蒸馏水溶解后稀释至1000mL。
（2）0.1%标准葡萄糖溶液
准确称取已烘干的无水葡萄糖1g（无水葡萄糖预先在烘箱内以110℃烘干至恒重，时间约2h），用少量蒸馏水溶解，加入5mL盐酸防腐，并用蒸馏水定容至1000mL。
2、测定步骤
①斐林氏液的标定（即空白滴定）
吸取斐林氏甲、乙两液各5mL于250mL三角瓶中，预加0.1%的标准葡萄糖液适量，加蒸馏水10mL，（以煮沸时斐林氏液仍呈现蓝色者为宜。如斐林氏液变为无色，说明加糖量已过量，应重做）。煮沸2min后，继续滴加0.1%葡萄糖液至蓝色刚变成无色为终点。继续滴加的操作，应在1min内完成。记录所耗标准葡萄糖的总毫升数A。
②定糖
Ⅰ、准确吸取斐林氏甲、乙液各5mL放入250mL三角瓶中。
Ⅱ、用吸管吸取1mL检液加入三角瓶中，从滴定管加入0.1%标准葡萄糖液约10mL。
Ⅲ、置电炉上加热煮沸2min（如发现蓝色消失，则表示检液过浓或标准葡萄糖液过量，应予适当的稀释或认少的检液重做）。
Ⅳ、在沸腾下继续滴加0.1%标准葡萄糖液至蓝色刚消失为终点。此操作必须在1min内完成。记录所耗标准葡萄糖的总毫升数B。
3、结果计算
以上测定取得准确结果后，可按下式计算检液中的还原糖含量。

式中： A--空白滴定所耗标准葡萄糖液总毫升数
B--测定检样时所耗标准葡萄糖液总毫升数
C--标准葡萄糖液的体积百分浓度
n--检液的稀释倍数。（ ）
V--滴定时所吸褥液的mL数
（二）EDTA定钙法
取发酵液1mL或2mL滴到盛有100mL蒸馏水的三角瓶中，然后加入10mL 1M氢氧化钠溶液与1～2滴钙指示剂，用EDTA溶液滴定，溶液由紫红色变成纯蓝色为终点。
乳酸含量9×Vr/V吸（g/L）
Vr ：滴定终点所用EDTA溶液的毫升数
V吸 ：吸取发酵液的毫升数
EDTA溶液：0.05mol/L
钙指示剂溶液：1g钙指示剂（铬蓝黑R）碾碎溶于100mL水中，或混合碾碎于100g食盐固体粉末中。
（三）氨基氮的测定
吸取发酵液 2mL，加水100 mL，加入酚酞指示剂3滴，用0.1M氢氧化钠标准溶液滴至初现微红色，不用记录用量。加入36%中性甲醛10 mL，摇匀，放置1min，再用0.1M氢氧化钠标准溶液滴定至呈微红色，记录滴定氢氧化钠标准溶液的毫升数。
氨基氮（g/L）VNaOH× MNaOH× 14/2
VNaOH ：氢氧化钠滴定体积（mL）
MNaOH ：氢氧化钠摩尔浓度（mol/L）
14：每摩尔氢氧化钠相当的氮质量
2：发酵液体积（mL）

实验结果记录
1.还原糖测定
菲林试剂的标定
0.1%葡萄糖用量：26.1ml

时间
h 菲林试剂甲液/ml 菲林试剂乙液/ml 检液
/ml 所耗葡萄糖液 还原糖
%
24
5
5
1 25.8
36 31
48 33
60 29.6