荧光免疫层析定量检测系统的设计与实现

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第27卷 第9期2013年 9月电子测量与仪器学报JOURNAL 0F ELECTRoNlC MEAsUREMENT AND lNsTRUMENTlf．27 Ⅳ0．9· 859·DOI：10．3724／SP．J．1187．2013．00859荧光免疫层析定量检测系统的 设计 与实现刘 翔 ’ 杜 民 李玉榕 ， 高跃明 ，(1．福州大学物理与信息_【=程学院 福州 350000；2．福建省医疗器械和医药技术重点实验室 福州 350000；3．福州大学电气工程与自动化学院 福州 350000)摘 要：荧光免疫层析定量检测技术正被广泛应用于临床检测领域，实现基于该技术的定量检测系统具有实际意义。针对这一目的，通过设计光学机构与电子电路，实现了一套完整的荧光免疫层析定量检测系统。该检测系统包括荧光信号检测，信息处理以及上位机软件等功能模块，可自动控制样本定量检测的全过程，最终输出结果。实验表明，系统最小可测的荧光物质溶液浓度量级为0．001％；测得的数据重复性误差为1．3％；定量结果误差小于2％。系统对荧光分析样本的测试快捷准确，具有重要的意义。

关键词：定量检测；自动检测；荧光分析；免疫层析技术中图分类号：TP301．6 TH776 文献标识码：A 国家标准学科分类代码：510．4030Design of fluorescence immune-chromatographic quantitative detection systemLiu Xiang ， Du Min Li Yurong。， Gao Yueming ’(1．Colege of Physics and Information Engineering，Fuzhou university，Fuzhou 350000，China；2．Fujian Key Laboratory of Medical Instrumentation＆Pharmaceutical Technology，Fuzhou 350000，China；3．College of Electrical Engineering and Automation，Fuzhou University，Fuzhou 350000，China)Abstract：Fluorescence immune—chromatographic quantitative detection technology is now widely used in clinicaldetection，thus realizing the detection processing system has practical significance．For this reason，based on fluores—eence immune—chromatographic quantitative detection technology，the fluorescence immune—chromatographic quanti—tative detection system with reasonable design of optical and electronic circuit is realized．The system is of high in-tegration degree with many modules，such as fluorescence signal detection，information processing and PC software，the whole detection process，including motion control，data acquisition，data analysis and other steps，the final out—put，can be automatically controlled．The experiments show that the system’S performance is excellent，the fluores—cent substance concentration level minimum detectable is 0．00 1％ ；the measured data has good reproducibility，therepeatability error is 1．3％ ；the quantitative results are accurate，the quantitative error is less than 2％ ．Therefore，the test of fluorescent analysis sample of the system is quick and accurate，it has vital signifcance.

Keywords：quantitative detection；automatic detection；fluorescence analysis；immune—chromatography引免疫口 层析检测技术是一种建立在层析技术与抗原抗体特异性反应基础上的免疫检测技术 。

荧光免疫层析定量检测技术是在免疫层析技术的基础上，利用荧光定量分析技术对标记物浓度进行定量检测的一种新方法。该方法继承了胶体金免疫层析法操作便捷、可现场检测的优势，同时利用荧光持续稳定的特性，较好地克服了胶体金免疫层析法测量时间长与结果不稳定两大缺点，具有灵敏度高、特异性强、快速、操作简便以及可现场快速筛查等特点 。可用于床旁即时检测，即 POCT收稿日期：2013-03 Received Date：2013-03基金项目：科技部台港澳合作项目(2012DFM30040)、福建省产学合作重大项目(2011Y4007)电子 测 量 与 仪 器 学 报 第27卷(point—of-care testing)[7-83。

荧光免疫层析检测技术飞速发展，基于该技术的定量检测系统的研究也不可或缺。检测系统的一 体化程度、智能化程度直接影响着系统的检测准确度、检测时间以及检测便捷度。因此，研究并实现一套功能完整的荧光免疫层析定量检测系统具有十分重要的临床价值与实际意义。为此，设计了一 体化荧光免疫层析定量检测系统，集检测机构运动控制、荧光信息调理与采集、荧光信息处理、浓度计算，样本编号录入以及结果存储等各个功能模块，实现了以荧光免疫层析定量检测技术为基础的定量检测。

2 系统原理与结构2．1 免疫层析检测技术原理免疫层析检测是利用亲和层析法的原理，实现相同生物学特性的组分相结合、不同生物学特性的组分相分离，结合特异性免疫反应原理，通过一定的手段，实现待测物浓度的定性或定量分析。

免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动。待测物在T线处发生特异性免疫反应，游离物在C线处发生免疫反应 ，如图 1所示。

图 1 免疫层析技术原理Fig．1 Schematic diagram ofimmune—chromatography2．2 测试样本的荧光特性检测系统实验所用的被测样本是一种结合了荧光物质的纳米级微球溶液。荧光物质选用铕元素及其螯合物，具有较宽的激发光谱带和较窄的发射光谱带，不易衰减且荧光光谱斯托克斯位移较大。其灵敏度好，特异性优良并且不具放射性污染，在临床实验与科学研究中应用广泛 。 。

在实验过程中，通过不断稀释荧光微球浓度为2％的母液，以得到不同浓度梯度的待测试样本，以验证检测系统性能。图2为利用光谱仪测得的母液荧光光谱曲线。从图中可以看出，样本的峰值激发波长约为340 nm，峰值发射波长约为610 am，斯托克斯位移达到了270 nm，可以很容易地利用光谱分辨技术排除激发光的干扰。

图2 待测试荧光纳米微球溶液的荧光特性Fig．2 Fluorescence characteristic of the measuredfluorescence nanometer microsphere liquor2．3 检测系统结构所设计并实现的自动荧光免疫层析定量检测系统的结构框图如图3所示。

1 l- 荧光信号采样电路板 ·图3 荧光免疫层析定量检测系统的系统Fig．3 Block diagram of fluorescence immune-chromatographic quantitativedetection system从系统框图中可以看出，检测系统主要由模拟信号调理与采样电路与数字系统控制电路组成。

第9期 荧光免疫层析定量检测系统的设计与实现这样的设计主要是为了保证测量结果的精确度，两者分开有利于使经由光电传感器输出的荧光信息模拟信号不受数字电路的干扰，保证采样结果的准确性 ¨。同时采样电路控制芯片采用 PIC单片机PIC24F16KA301，该芯片功耗低，包含12位A／D采样模块，采样速度快，精度高，以此确保采样电路的输出结果稳定可靠，图4给出了采样电路具体的原理框图。另外，检测系统主控制电路以 8051F020单片机为核心，搭载 RTOS-51实时操作系统，控制如图3所示的各个功能模块协同运行，完成荧光免疫层析定量检测系统的测试过程。

模拟信号输入图4 采样电路原理框图Fig．4 Block diagram of sample circuit2．4 检测系统工作过程检测系统的测试过程如下：用户通过用户接口控制检测系统开始测试，步进电机控制试剂卡插槽送卡，光学模块测得待测样品试剂卡的荧光强度，经光电传感器转换为模拟电信号送入采样电路板，采样电路对输入的模拟信号进行信号调理与采样，得到荧光强度数字信号通过总线发送给主控制板。

主控制板进行数据进一步处理以及样品浓度计算，处理结果通过液晶显示，由用户确认后选择是否保存与打印。至此该样品的测试工作结束。

3 样本荧光信息的获取系统前端获取的荧光信号，是实现定量检测的前提和决定检测精度的关键所在。系统前端包括光学测量机构与模拟信号调理电路。

3．1 光学测量机构光学测量机构的主要功能是产生所需要的紫外激发光，以及接收被检样本受激发所辐射出的荧光信号转换为模拟电信号输出。因此，光学测量机构由紫外光激发部分和荧光接收部分组成，结构图如图5所示。

图5 光学测量系统结构Fig．5 The structure of opticalmeasurement system测量开始后，紫外光源打开，激发光经过聚焦后被分色镜反射，再通过聚焦镜聚焦，光斑经柱面镜转换为线斑，聚焦到待测样本表面。此时，试剂卡来回运动进行扫描。样本受激发后产生的荧光信号由聚焦镜聚焦为平行光，通过分色镜与滤光片滤除杂光，再经由聚焦镜聚焦到光学传感器上，转换为电信号。

采用紫外光 LED作为激发光源，相对于其他紫外光源，紫外光 LED具有低能耗、效率高、发热量小、功率与波长稳定等优点，同时紫外光 LED体积小，激发系统相对简单，便于搭建。图6为所选紫外光 LED的光谱归一化理论值。从图中可以看出，光源可以产生与待测样本峰值激发波长想接近的340 nm激发光，符合系统需求。在5．1节中给出了经光学测量机构所产生的激发光的效果图以及测得的光谱。

Wavelength／nm图6 紫外光 LED的理论归一化光谱Fig．6 The normalized spectrum of UV LED电 子 测 量 与仪 器 学 报 第27卷3．2 模拟信号调理电路光电传感器将接收到的荧光信号转换成电信号之后，信号幅值为 mV级，还需对信号进行放大滤波。放大电路选用专用的单片集成仪器放大器芯片 川J，目前常用的仪器放大器芯片有 AD620／622以及INA1 18／128／129等。表 1给出这些仪器放大器的性能对比。可见，AD620输入偏置电流最小，输入失调电压<50 V，共模抑制比性能优异，且工作带宽较大。因此作为检测系统的一级放大电路较为合适。在一级放大电路输出端，续接 RC低通滤波电路就可以得到优质模拟电信号。在5．2节中给出了对该模拟信号直接进行采样的数据波形。

表1 仪器放大器芯片性能对比Table 1 Comparison of instrumentamplifer chip performance4 定量检测的荧光信息处理方法4．1 信号预处理鉴于荧光信号波形较平缓且存在毛刺，而中值滤波对于去掉偶然因素引起的波动或采样器不稳定而造成的误差所引起的脉冲干扰比较有效，对变化相对缓慢的被测参数采用此法能收到良好的滤波效果 。系统采用中值滤波对采集到的荧光数据进行预处理。中值滤波是对某一被测参数连续采样Ⅳ次(一般Ⅳ取奇数)，然后把Ⅳ次采样值从小到大，或从大到小排队，再取其中间值作为本次采样值，即g=median[f1 ，? ] (1)式中：median[]表示在第1到Ⅳ个数中取得的中间值。

经过中值滤波处理后的荧光数据已经比较平滑，但仍附带一些幅值不大的噪声，观察其频域特性，发现其主要组成部分为5O Hz工频噪声，因此，还需进行 50 Hz工频滤波。在本检测系统采样频率为200 kHz的情况下，理论上采用4点平滑滤波器即可滤除工频噪声 。为获得更好的平滑效果，系统采用8点平滑滤波器进行针对50 Hz工频噪声的滤波处理，该方法简单，处理速度快，滤波效果好，同时对高频噪声也有一定的抑制作用，能够满足本系统需求。其传递函数为：1( )=÷(1+ -1+ 一 十 一 + 一 +Z一 +_6+ -7) (2)在5．2节中给出了经过信号预处理后所得到的数据波形。

4．2 基于3次样条插值的定量拟合模型在荧光免疫层析定量检测系统中，由于传感器线性特性，放大器线性，电路性能等并不能达到理论值，因此荧光强度与样本浓度的刻度曲线并非绝对线性，若使用线性拟合，会使检测结果存在一定的误差，有必要引入非线性拟合。在非线性拟合算法的选择上，3次样条插值算法与其他常用的非线性拟合算法相比，拥有拟合光滑度好，算法稳定以及计算简单 3大优势 J，其拟合结果可适当地补偿测量过程中这些不可避免的误差，提高检测结果的准确性。为此，系统采用 3次样条数值拟合模型，建立荧光强度与样本浓度的刻度曲线。

3次样条插值算法如下：定义 S( )∈C [a，b]，且在每个小区间[ ， ]上是 3次多项式，其中a= < ，

5 实验结果与讨论5．1 检测系统激发光的光路性能测试将空白待检测试剂卡置于光学测量机构下方，测试紫外激发光的光路性能，图7为效果实物拍摄图，可见光学机构能够产生与待测试剂卡的测试窗口相对应的线光源。图8为用光谱仪测得并经过归一化的线光源光谱，从图中可以看出，在将紫外光LED光源转换为线光源的同时依然保留了紫外光LED的光谱特性，由此可见，激发光路性能优异，匹配了待测样本位置及其荧光特性。

图7 光学机构的紫外激发光产生效果实物Fig．7 The picture of UV excitatedwith optical mechanismWavelength／nm图8 实测线光源归一化光谱Fig．8 Normalized spectrum of themeasured 1ine source5．2 检测系统电性能测试将一定浓度的荧光纳米微球溶液滴加于待测试剂卡上，用检测系统进行测试，分别输出模拟信号的采样值，如图9所示，以及该信号经过信号预处理后的波形，如图 10所示，图中横坐标为采样点，纵坐标为系统采样幅值。从图9中可以看出，本系统所设计的模拟信号调理电路性能达到了预期效果，如3．2节中所述，系统的采样波形已经基本平滑，仅留有一些幅值不大的噪声，而据傅里叶变换结果求得该噪声主要为50 Hz工频干扰，从图lO中可以看出，针对工频干扰所设计的数字滤波l 200200 400 600 800 l 000 l 200Sampling Points图9 对信号调理电路输出端直接采样得到的波形Fig．9 Original AD sampled waveform at theoutput of signal conditioning circuit200 400 60o 800 1 000 1 200Sampling Points图 1O 经过预处理后的信号波形Fig．1 0 The signal waveform after pre-processing湖 鲫 枷 瑚 ou EI1鼻昌瑚 咖 ㈣ 伽 瑚 o【l口马《电 子 测 量 与 仪 器 学 报 第27卷器不但计算简单，而且达到了非常优异的效果，使信号波形得到了更进一步的优化。

5．3 检测系统整体性能测试1)系统检测限测试：将浓度 2％的荧光纳米微球溶液进行多比例稀释，得到 50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1 600倍、3 200倍的稀释溶液，分别滴加在不同的待测试剂卡上，以空白试剂卡作参照，用定量检测系统进行多次测量取平均值，表2给出了低浓度时的测试结果。

从表2中的数据可以看出，系统可检测 1 600倍的稀释溶液，即检测限可达到0．001％的荧光物质浓度量级。

表 2 系统检测限测试结果Table 2 Measurement results of the detection limit稀释浓度(倍数) 测试结果(采样值)80o1 6003 200空白0o87OO400007O0052)测量结果重复性测试：取之前做电性能测试的样品作为重复性测试对象，在相同测量条件下测量多次，得到8组数据，如图11所示，图中横坐标为采样点，纵坐标为采样幅值。由图中数据计算可得测量误差： ^ 100％ ×100％ ·3％ (7)图 l1 检测 系统测量重复性实验结果Fig．1 1 Detection result of repeatability3)检测系统定量精度测试：在测量定量精度这一步，利用之前第一步实验测得的几组数据，取50倍、100倍、400倍、800倍及1 600倍的测试结果作为已知点建立3次样条曲线，其结果如图 12所示，图中纵坐标为采样幅值，从图中可以看出，如4．2节中所述，3次样条模型拟合曲线平滑且并非绝对线性，对、?贝0量得到的荧光强度信息中所存在的非线性误差有相应的补偿。

图 l2 浓度与荧光强度的刻度曲线Fig．1 2 Calibration curve of concentrationand fluorescence intensity以稀释200倍的荧光物质溶液作为待测样本，进行测量并计算实测真实值与曲线理论值之间的误差。如表3所示，从表3中数据可以看出，检测系统测量误差小于2％。在性能测试过程中，以德国ESE公司的研发样机测试结果作为对比进行讨论。ESE样机测得稀释 1 600倍的溶液采样值为38，而稀释3 200倍的溶液也无法测得，另外重复性测量误差约为 1．5％，定量精度误差小于2％。

由此可见，所设计的检测系统与ESE样机的检测限一致；测量结果重复性略优；定量精度达到 ESE样机水平。

表 3 真实值与理论值的误差测试结果Table 3 The error of real value and theoretical value第9期 荧光免疫层析定量检测系统的设计与实现 ·865·6 结 论荧光免疫层析定量检测系统利用合理的光学测量机构与电学分析模块，可以实现待测试剂卡上荧光物质的定量检测，检测限达到荧光物质溶液浓度量级0．001％，测量结果可靠、重复性好，相对误差仅有 1．3％，测量结果定量精度高，测量误差小于2％。而且，系统功能完整，操作方便，可广泛应用于以荧光免疫层析定量检测技术为基础的定量检测领域，如医学床旁检测，食品安全检测等。

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作者简介刘翔，1989年出生，现为福州大学物理与信息工程学院信号与信息处理专业在读硕士，主要研究方向为生物医学仪器及智能检测。

E—mail：sugoyileo### gmail．conLiu Xiang was born in 1989，M．Sc．candidate in FuzhouUniversity． His present research interests include biomedicalinstrument and inteligent detection.

杜民(通讯作者)，1955年出生，福州大学电气工程与自动化学院博士毕业，现为福州大学教授与博士生导师，福建省医疗器械和医药技术重点实验室主任，主要研究方向为智能仪器与光电系统。

E—mail：fjkeylab###163．conDu Min(Correspounding author)was born in Fujian，China，in 1955．She received Ph．D．in electrical engineeringfrom Fuzhou University，Fuzhou，China．She is currently a pro—fessor and a Ph．D．supervisor at Fuzhou University．She is al—SO the director of the Fujian Key Laboratory of Medical Instru—mentation and Pharmaceutical Technology．Her research inter—ests include smart instruments and photoelectrical system.