基于电动驱动的中心切割二维分离检测系统

二维分离是近年来发展起来的-种新型复合分离技术，与- 维分离模式相比，二维分离可以极大地提高分辨率 ，便捷地调整分离选择性，待测组分在不同的分离模式、即不相关的保留机理下进行分离，各组分间的分离效率不受后续分离的影响，而且能从复杂基体 中排除干扰物质，有选择的针对 目标组分进行分析。迄今为止，二维色谱的研究已比较成熟，然而二维毛细管电泳的研究还处于试验阶段 ，主要原因是二维间的切换接口难于制作，目前的微加工技术难以达到毛细管柱对柱外死体积的要求，已报道的二维毛细管接13有微透析接口1.2j、多孔蚀刻接133 J、十字交叉型四通接口 、微进样器接13 E5]、切向开孔接口6 和微孔接口 等，上述二维毛细管电泳接口存在柱间死体积大、柱外效应高、柱效损失大等缺陷 ，严重损失整个分离系统的分离效率和分辨率；且在二维切换接口处区带扩散基金项目：国家自然科学基金(20775039)；青岛理工大学横向课题(z-2012-275)收稿日期：2012-12-24 收修改稿 日期：2013-04-20严重、或损失部分待测物，影响检测灵敏度，为提高灵敏度，采用激光诱导荧光(LIF)、质谱(MS)等高灵敏检测器，但 LIF和MS检测使整个二维分离检测装置复杂，且价格昂贵。

为克服二维毛细管电泳接口制作的难题，Anouti等研究了在-根毛细管中进行中心切割二维毛细管电泳分离 J，样品进行第-维分离后，用压力将目标组分驱送到毛细管入口端进行第二维分离，但在压力驱送过程中存在严重的区带扩散，使分离效率降低。为减小区带扩散，将毛细管内径减小到5 p.m9 J，导致进样量非常小 ，只能采用高灵敏检测器，使分离检测体系复杂化。电化学检测灵敏度高、设备简单、价格低廉、易于微型化和集成化 。在前期研究中，课题组尝试 了中心切割二维毛细管电泳电化学检测用于复杂样品的在线纯化分离 ，检测灵敏度高 ，二维切换过程中无样品损失，但在二维切换过程中采用压力驱动 ，自动化程度低，重现性低。

为克服上述问题，在前期研究的基础上设计了-种集采样、中心切割二维毛细管电泳分离、在柱电化学检测和数据采集功能于-体的二维分离检测系统。采用电泳和电渗等电动84 Instrument Technique and Sensor Ju1.2013驱动二维分离全过程，装置简单、无区带扩散、自动化程度高、重现性好；运用在柱电化学检测控制二维切换，无样品损失、灵敏度高 、易于微型化和便携现场实时分析。利用最终搭建的中心切割二维分离检测系统对复杂样品血样中6种 B-阻断剂药物进行分析 ，验汪系统的各项性能。

1 系统设计部分1.1 电动驱动中心切割二维分离检测原理基于电动驱动的中心切割二维毛细管电泳分离在柱检测原理如图 1所示：首先样品溶液在电泳和电渗流的作用下进入毛细管，向检测端迁移的同时进行第-维分离，样品基体中的干扰成分(A和 C)与目标组分 (B)分离成不同的区带，迁移速率较快的干扰组分 A从检测端排出(图 1(a))；-旦工作电极检测到日标组分(B)的信号，立即停止分离电压 ，在检测池中换上第二维分离缓冲液并开肩电渗泵 ，溶液在电渗泵的驱动下 向毛细管入口端迁移，将迁移速率较慢的干扰组分 C从毛细管入口端排出，同时第二维缓 冲液从检测端进入毛细管中(图 1(b))；当日标组分 B到达毛细管入口端时，停止电渗泵，将毛细管入口端缓冲液池换成第二维分离缓冲液(图 1(e))；启动分离电压，目标组分 B进行第二维分离(图 1(d))。

第-维缓冲液第-维缓冲液(b)第二维缓冲液第二维缓冲液(d)图1 电动驱动中心切lJ]-维分离检测原理图1.2 系统总体结构设计的基于电动驱动的中心切割二维毛细管电泳分离在柱检测系统由电渗泵、电磁切换阀、高压电源、毛细管、场隔离接头 、电化学检测系统等硬件及软件系统组成。系统的整体结构如图2所示，采取分步研究 -集成调控 -分析应用的步骤，首先分别研究系统的各功能单元；然后研究多通道切换分析接口卡和 VC语言程序，将各功能单元通过计算机控制实现 自动化操作，并没汁USB数据采集电路 ，实现数据的采集 、存储和图谱的绘制；最后将电动驱动中心切割二维分离检测系统集成为自动化程度高的智能分析，并应用到复杂样品的在线纯化 、分离检测。

废液池 计算机图2 系统总体结构图1.3 电渗泵系统设计电渗泵用于第-维分离结束后二维切换过程中将迁移速率较慢的干扰组分 C从毛细管人 口端排出、目标组分 B驱送到毛细管人 口端、同时将第二维缓冲液从检测端吸入毛细管中(图1(b))，其结构如图 3所示，泵芯为多孔玻璃芯柱 ，泵芯外壳为玻璃管，管两端与泵电极腔通过管套螺纹密封相连，电极腔位于多孔芯柱两端，电极置于电极腔 内，电极腔的内外载流之间用醋酸纤维素膜隔离，泵体两端分别设有输人、输出载流管，载流管上设有阀门。电渗区为固定于玻璃管内的多孔玻璃芯柱(60 mm ×9 mm i.d.)，泵流量和流向通过改变泵电压和极性控制。流量范 围为 10～ ～5 mL/min，驱动效率为 1-6mL/(min·mA)，同常规蠕动泵和注射泵等机械泵驱动相比，采用电渗泵驱动流量稳定无脉动、流量范围大、驱动效率高、容易控制电压的高低和极性变换，并且电源通用 、控制方式统-、结构简单和操作方便。

图 3 电渗泵结构示意图1.4 在柱检测系统设计在柱检测系统由电场隔离接头、三电极检测系统和检测器三部分构成，如图4所示。为消除高压分离电压对在柱检测的影响，制作了激光刻蚀电场隔离接头，首先在距毛细管出口端1.5 em处，用刀将毛细管-侧的聚酰亚胺涂层刮掉 5 mm，去掉涂层的部分用激光刻蚀 26个凶 ，每个孔的直径 25 m，孔间距195 m，然后在刻蚀部分均匀涂敷-层醋酸纤维素浆，待凝固后，即形成只通过电流而无溶液泄漏的电场隔离接头～电场隔离接头固定在接地电极池中，在池中加入缓冲溶液并插入Pl电极作为电泳接地电极。三电极检测 系统即 Pt工作电极、第 7期 张效伟 ：基于电动驱动的中心切割二维分离检测系统 85Ag/AgC1参比电极和 Pt辅助电极 ，在显微镜下将直径 20 m的Pt工作电极从毛细管出口端插入 0.5 cm，与场隔离接头和分离毛细管成-直线，工作电极、辅助电极和参 比电极分别从 3个不同位置插入聚四氟乙烯检测池中并用螺丝固定。检测器提供在-1O.0o-10.o0 V范围内由计算机程序控制的恒电位输出和可变电位输出，三电极数据线和机身整体具有较好的环境电磁屏蔽效果，恒电位检测信号输送至微 电脑 的 UBS输入接口。采用高性能的集成放大系统、高分辨率的电位扫描系统和高精度数据采集分析系统，以保证电位检测的测试性能。扫描速率为0～200 V/s，电位波动小于 0.05%，电流信号波动小于0.05%，数据采集频率为1-1 000 Hz。

接地电极池 接地电极 辅助电极图4 在柱检测系统示意图1.5 系统软件设计系统软件设计包括控制单元和数据采集单元，实现下述功能：电动进样控制，第-维分离控制，电渗泵电压和极性控制，电磁阀切换控制，第二维分离控制，数据采集和软件滤波。系统的软件采用 VC语言编程，采用多线程技术，在工作线程中进行数据采集，并实时显示，使系统控制与数据采集协调执行，为操作者提供方便的可视工作界面，实现包括进样、第-维分离、二维分离切换、第二维分离、检测等功能。采用菜单式用户界面，系统启动后进入主菜单，菜单分为控制和数据采集两部分。

控制部分流程图如图 5所示，提供整体系统的协调控制、硬件系统运行参数的设置等。

数据采集信号处理软件采用 VC语言编程，可以在程序的菜单中方便地选择开始或停止数据采集 ，并能进行参数调整。

数据采集部分流程 图如图 6所示 ，含测量、历史记录、通信等项，测量子菜单可选择测量对象的各种参数、启动测量过程等；历史记录子菜单可显示以前测量的结果，可绘制曲线；通信子菜单可选择数据传送参数、启动传送过程等。通过该单元对采样数据进行处理，可以进行-维、二维数据的分析，通过标准的数据接 口和文件格式，进行数据的切割 、存储、输入 、输 出等操作。输出的标准数据文件 ，可以在其他专业数据处理软件(例如 Origin)中，进行更为通用和专业的处理。

2 实验部分2.1 试剂6种 B-阻断剂药物烯丙洛尔、拉贝洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、阿替洛尔、纳多洛尔均为市售药物(购自青岛医保城)。

十二烷基硫酸钠(SDS)、冰醋酸(HAc)、无水醋酸钠(NaAc)、乙腈均为分析纯。

(墨壁 塑)系统操作说 明 l I预 启 动 设 备 到 工 作 状态甲 - 维分 》 -维分离参数调整子程序/电渗泵结NYNt/ N图5 系统软件控制部分函数流程图J互赫士n帕 l 采 信 -.阍 电 号I 筝茸他极 数分析参数设定 1 电谱 据 ' 数据的 输出处 流 霞 - 理 l叫垂垂 采 像 于即 I理软件 分析过程启动 样图6 数据采集部分函数流程图血样准备 ：取大鼠2只，将 6种药物均按30 me，/kg给药，给药后2 h收集5 mL血样，加入 1 mL乙腈沉淀蛋白，涡流混合2min，4 000 r·min 离心10 min，过滤，冰箱保存。

2.2 实验方法电动驱动二维分离系统使用前依次用1.0 mol/L HC1冲洗5 rain，水冲洗 1 min，1.0 mol/L NaOH冲洗 10 rain，水冲洗 1min，用第-维分离缓冲溶液平衡 10 min.操作步骤见表 1。首先，毛细管内充满第-维分离缓冲液(15 mmoL NaAc/HAc)，样品缓冲液池中注入待测血样，将电磁阀置于①位(图2)，接通高压电源，血样在1O kV下电动进样10 s；然后将样品缓冲液池中换成第-维分离缓冲液，血样在 1O kV下进行第-维分离，血样中迁移速率比13-阻断剂快的物质从检测端排出毛细管，-旦工作电极检测到 B-阻断剂的信号，立即停止分离电压；将检测池中换成第二维分离缓冲液(90 mmoL NaAc/HAc30 mmol/L SDS)，同时将电磁阀置于②位，开启电渗泵，血样Instrument Technique and Sensor Ju1.2013中迁移速率比 13-阻断剂慢的物质从毛细管入 口端排出，同时将第二维分离缓冲液从检测端吸人毛细管中，电渗泵的流量为3 mL/min，此时毛细管中的溶液以0.76 cm·s 的速度流向进样端 ，B-阻断剂在 77 s时到达毛细管入口端，为防止待测物在毛细管入口端损失，75 s时停止电渗泵；毛细管人 口端的样品缓冲液池中换成第二维分离缓冲溶液，6种8-阻断剂在10 kV下进行第二维分离检测。

表 1 系统的操作步骤3 结果与讨论为考察电动驱动中心切割二维分离检测系统的性能，实验以血样中的 6种 B-阻断剂为检测物质，分别对进样、第-维分离、第二维分离、二维切换及检测条件进行了优化，选择进样和分离电压 10 kV，进样时间10 s；第-维分离缓冲液为15 retool/L NaAc/HAc，pH 4.3；第二维分离缓冲液为 90 mmol/L NaAc/HAc30 mmol/L SDS，pH 4.3；电渗泵流量为3 mL/min；检测电位 0.8 V.整个二维分离过程的电泳谱图如图7所示，从图中可以看出，经过第-维分离纯化后，血样中的干扰物质被排出毛细管中，第二维分离六种B-阻断剂时无干扰峰，血样中的6种B-阻断剂得到了很好的分离和检测。

150 300 450 600 750tJsl-噻吗洛尔；2-吲哚洛尔；3-烯丙洛尔；4-拉贝洛尔；5-阿替洛尔；6-纳多洛尔图7 电动驱动中心切割二维分离在线纯化分离检测血样中的13-阻断剂研究了6种 p-阻断剂的工作曲线、线性范围、回归方程、检出限和分离效率，如表2所示，检出限为3.5-12.6 L，分离效率为(5.2-9.6)×10 plates/m。样品连续测定 8次，分别计算6个峰的峰高、峰面积和迁移时间的相对标准偏差，其值分别为 1.6% -3.3%、1.2% ～2.8%和 0.7% -2.2%，结果表明该系统重复性好。为验证系统的可靠性，对血样进行了回收率实验，回收率在93.6%-105.1%之间，表明系统准确可靠，可用于实际样品的测定。

表 2 方法的分析性能参数注：，的单位 nA；C的单位 mg/L。

4 结束语文中设计并实现了基于电动驱动的中心切割二维分离在柱检测系统。系统采用电泳和电渗等电动作用驱动二维分离全过程，无样品区带扩散、分离效率高、自动化程度高、重现性好 ；采用电磁阀切换和在柱检测控制二维切换过程，无样品损失、灵敏度高、易于微型化和便携操作。利用该系统实现了复杂样品血样的高分辨率、高灵敏度检测，峰高、峰面积和迁移时间的相对标 准偏差分别为 1.6% -3.3%、1.2% -2.8% 和0.7% -2.2%，检出限为 3.5-12.6 tLg/L，分离效率为(5.2-9.6、×10 plates/m。