基于电渗驱动电磁阀切换恒电位检测的微全分析系统

近年来，随着微制造技术的发展，科学仪器的小型化、集成化、自动化已成为-个重要研究方向 -2]。Harrison等发明了微芯片流动分析系统 J，利用微加工技术，在-块很小的玻璃上刻出微通道进行电泳分离。Dasgupta等提出了电渗泵微流动注射分析 J，采用单根毛细管电渗驱动进行流动注射分析。 目前的微全分析系统将许多不连续的过程(如样品制备、反应、分离等)集成到-块芯片上，试剂消耗降低到 升至nL级，分析速度大大提高，费用大幅下降。但由于进样量少，使检测难度增大，通常采用灵敏度较高的检测方法，如激光诱导荧光 J、质谱 、化学发光 等。这些检测设备体积大、价格昂贵、光学结构复杂，难以实现整个系统的微型化，不能满足人们对分析仪器便携式的要求。此外，用微流器件、微芯片或毛细管组建微分析系统，需要使用不同的接口装置、混合流路基板，或不同分基金项目：国家自然科学基金项 目(20775039)和青岛理工大学横向课题(Z-2012-275)收稿日期：2013-01-14 收修改稿日期：2013-O3-o6析功能的微芯片，已报道的微分析系统在制作或操作上较繁琐。

电化学检测灵敏度高、设备简单、价格低廉，易于微型化和集成化 I9 J。在前期研究中，研制了毛细管电泳电化学免疫分析系统，用于检测贝类样品中的记忆缺失性贝毒 、麻痹性贝毒 和腹泻性贝毒H ，灵敏度高、选择性好，但采用流体压力驱动溶液，脉动大；手动切换溶液，自动化程度低。

文中研制了基于电渗驱动电磁阀切换恒电位检测的微全分析系统。用该系统检测工业废水中的大肠杆菌，检出限为93cfu/mL，分离效率为7.8×10 plates/m，同文献[1O-12]相比，灵敏度提高8倍，分离效率提高3倍。40 min内就能完成对大肠杆菌样品的快速检测。

1 微全分析系统的设计微全分析系统由可控高压电源、电渗泵、电磁切换阀、分离毛细管、反应毛细管、恒电位检测及控制和数据采集拈组成，如图1所示。首先将电磁阀置于a位并开启电渗泵P2进样；进样完毕后将电磁阀置于b位，电渗泵 P2从缓冲液池1中吸入缓第8期 张效伟：基于电渗驱动电磁阀切换恒电位检测的微全分析系统 67电渗驱动电磁阀切换恒电位检测的微全分析系统主处理器图5 微全分析系统各单元集成化流程图行，实现包括进样、溶液驱送、分离、检测等功能∝制部分函数流程(图6)包括整体系统的协调控制、硬件系统运行参数的设置、电渗驱动和电磁阀的切换控制、高压系统的调整及显示控制、恒电位检测控制等项。图6中，其他”表示返回上-步。

NY预启动设备到工作状态Y 电渗泵参数调整子程序Y 电泳分离参数调整子程序图6 微全分析系统系统控制部分函数流程图2 实验部分2.1 试剂辣根过氧化物酶(HRP)标记的大肠杆菌抗体；聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Mr1 300 000)、邻氨基酚(OAP)、NaH2PO4、NaOH、H2O2等。缓冲液池 1和2的溶液均为50 mmol/L Nail PO 1.0 mmol/L H2021.0% PVP，pH 7.6。

大肠杆菌的培养 ：将大肠杆菌菌种置于 LB培养液中，在37cc下震荡培养 18 h后，将菌液以8 000 r/min离心 2 min，弃去上清液后重悬于缓冲溶液中，离心2～3次，用缓冲液悬浮得到菌液。取0.1 mL菌液进行梯度稀释，采用平板计数法计数。其余菌液稀释得到系列浓度大肠杆菌标准样品。

免疫样品制备：大肠杆菌(抗原，Ag)与HRP标记大肠杆菌抗体(酶标抗体，Ab )进行非竞争免疫反应：AgAb (过量)-Ag-AbAb具体操作为：在200 的微孵育管中加入 1O Ag和10Ab ，用5.0 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.6)稀释至50 ，室温孵育30 min，大肠杆菌与酶标抗体进行免疫反应，反应后的免疫样品溶液中有生成的免疫复合物(Ag-Ab)和过量的Ab 。

2.2 实验方法微全分析系统的分离毛细管和反应毛细管使用前依次用1.0 mol/L HC1冲洗5 min，水冲洗1 min，1.0 mol/L NaOH冲洗10 min，水冲洗 1 min，缓冲溶液平衡 10 min。操作步骤见表1。

表 1 微全分析系统测定大肠杆菌操作步骤首先，将电磁阀置于b位(图1)，电渗泵 P1、P2分别吸入底物(OAP)和缓冲溶液于相应流路中；然后将电磁阀置于a位，P：吸人样品溶液；再将电磁阀置于b位，将样品溶液推人分离毛细管的入 口端 ；最后，电渗泵 P 、P2分别以 1 L/min的流量推动底物溶液和缓冲液沿流路前进，同时接通高压电源并开启恒电位检测系统，在电渗流作用下，缓冲液池2中的溶液进入分离毛细管，底物溶液OAP进入反应毛细管，大肠杆菌免疫样品溶液在分离毛细管中在 15 kV分离电压下进行电泳分离，样品中的Ab 和Ag-Ab 根据迁移速率不同分成2个不同的区带，并在电渗流推动下依次进入反应毛细管中。标记在Ab 和Ag-Ab 上的 HRP在反应毛细管中催化底物 OAP与 H：0 反应生成电活性物质AP，该电活性物质AP在电渗流推动下进入检测池后在 -0.35 V被还原 ，还原电流的大小与标记在Ab 或 Ag-Ab 上的 HRP的浓度成正 比，从而可对大肠杆菌进行定量检测。

3 结果与讨论为考察微全分析系统系统的性能，实验以大肠杆菌为检测物质，分别对大肠杆菌免疫反应、进样、电泳分离、酶催化反应、恒电位检测等条件进行了优化，选择免疫反应时间为30 min，进样时间为10 s，电渗泵进样流量为2 IxL/min，电泳分离缓冲溶液为 50 mmol/L NaH2PO41.0 mmol/L H2021.O% PVP，pH 7.6，OAP浓度为1.0 mmol/L，分离检测过程中，电渗泵P 、P：的流量均为 1 pL/min，检测电位为 -0.35 V。

图7为加入不同浓度的大肠杆菌时免疫样品的电泳谱图，检测大肠杆菌采用非竞争免疫反应模式 ，图 7(a)是大肠杆菌酶标抗体(Ab )的电泳谱图，加入不同浓度的大肠杆菌(Ag)并进行免疫反应后，免疫复合物(Ag-Ab )的峰出现(图7(b)、Instrument Technique and Sensor Aug.2013图7(C))，且随着大肠杆菌浓度的增大，Ag-Ab 的峰高增大。

螺餐时间，s(a)浓度为0时间，s 时间，s(b)浓度为 100 cfu/mL (c)浓度为500 cfu/mL图7 大肠杆菌免疫样品电泳谱图。

在最佳条件下研究了检测大肠杆菌的工作曲线、线性范围和检出限。图8为检测大肠杆菌的工作曲线图，在 160～3 000cfu/mL范围内，大肠杆菌的浓度与Ag-Ab 的响应成良好的线性关系，回归方程为Y0.28x1.10(Y为 Ag-Ab 的峰面积， c； 为大肠杆菌浓度，cfu/mL)，线性相关系数0.997 2，检出限为93 cfu/mL，峰 Ag-Ab 的分离效率为 7.8×10 plates/ITI.为验证该微全分析系统的灵敏度和分离性能，采用文献 [10- 12]的装置对相同的大肠杆菌免疫反应样品进行检测，检出限为750 cfu/mL，峰Ag-Ab 的分离效率为2.7×10 plates/m，说明研制的微全分析系统测定大肠杆菌的灵敏度比文献[1O-l2]装置测定的灵敏度提高了8倍，分离效率提高了3倍。

0喧誊暑蛊I图8 微全分析系统检测大肠杆菌的工作曲线为验证微全分析系统测定结果的可靠性，将该系统用于工业废水中大肠杆菌的检测，分别在某工厂排污口的3个采样点采集 3份样品，利用膜过滤技术进行浓缩，再分别平行测定 3次，并将该系统测定结果与国标法比较，如表 2所示。采用 F检验法判断 国标法与该 系统检测结果 的差异性，F：9.22<.粥19.37，说明两种方法检测结果无显著性差异 ，从而证明系统测定结果准确可靠。

4 结束语研制的基于电渗驱动电磁阀切换恒电位检测的微全分析系统将电渗驱动、电磁阀切换应用到毛细管电泳电化学免疫分析中，具有现场样品注入、溶液输运、分析反应、高效分离和恒电位检测等全部分析功能。用电渗泵驱动溶液、流量大、无脉动；用电磁阀进行不同溶液间的切换，操作准确、自动化程度高；恒电位检测装置简单、灵敏度高，易于微型化和自动化。该系统具有分离效率高、检测灵敏度高、测定结果准确可靠、仪器简单、携带方便等特点。