高效液相色谱研发和应用中关键问题的研究

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D0I：10.3969/j.issn.1001-232X.2013.O3.O11Study on critical question of development and application for HPLC.Li Changhou.(ShanghaiResearch Centre of B 0 8c 0Z0g Chinese Academy of Science，shanghai 200233，China)Abstract：The critical questions of development and application for HPLC were studied。

These questions impair the quality of instrument and influence analytical error of HPLC。

Key words：HPLC；high pressure pump；chromatographic column；detector1 前言高效液相以谱(HPLC)是科研、工农业生产工作中使用非常广泛的-种分析仪器。特别在食品药品和复杂体系的分析检测工作中，可以说是必不可少的分析仪器之-。但是，目前在 HPLC的研发、生产制造、使用和维修方面还存在很多问题，本文根据仪器学理论和作者的实践，研究总结了-些解决问题的办法，可供有关人员参考。

2 泵、柱、检测器三者的关系和 目前生产 、应用中存在的问题目前很多研发和使用 HPLC的科技工作者，没有搞清楚或没有完全搞清楚 HPLC中的泵、柱、检测器三者的关系，因此制造者生产的 HPLC问题很多，而使用者也不能将 HPLC用到最佳水平。积笔者长期的研发和使用 HPLC的实践经验，感到生产、使用 HPLC时，以下问题特别值得注重。

2.1 正确认识、处理 HPLC的泵、柱 、检测器三者的关系2.1.1 HPLC是-个系统，必须将泵、柱、检测器三者(3个部件)结合起来才能叫 HPLC。三者都合格，联机后的整机系统才有可能合格，但不能肯定系统就会合格。只有泵、柱、检测器三者质量都合格，并且联机后检测结果也合格，才能说 明这台HPLC是合格的。

2.1.2 3个部件都重要，谁是核心谁最重要看法各不相同、各有表述。应该说三者缺-不可，都很重要 。

2.1.3 笔者长期使用过 HPLC，也有多年研发HPLC仪器的工作经历]，实践使笔者深深认识到：必须将 3个部件联接起来检验测试，并能达到质量指标要求 ，才能说这台 HPLC达到 了质量要求。否则，只是部件合格，整机系统不-定能合格。因为：(1)泵会因为柱子问题产生压力不稳、流量不稳定 ，会影响 HPLC系统的质量 ；(2)柱对泵影 响很大。柱堵塞 、柱沾污 、柱接头漏液等，都会影响泵的压力波动、使流速不稳定；会影响系统不稳，使 RSD变坏、峰拖尾、灵敏度降低；(3)柱对检测器影响很大：柱效降低(柱塔板数作者简介：李昌厚，男，1939年出生，教授，博士生导师。1963年毕业于天津大学精密仪器系，后分配到中国科学院上海有机所、上海生物工程研究中心工作。长期从事分析仪器和仪器分析研究，取得科研成果 15项，获科技奖励 5项(其中国家发明奖 1项)，发表论文 180多篇，出版专著 5本。现任中国分析仪器学会副理事长、《生命科学仪器》杂志副主编等职。

2013年第3期 分 析 仪 器 45降低)、柱堵塞、柱的新旧程度、接头、管道漏液等，都会影响检测器的检测限、分辨率、噪声、和灵敏度。

2.2 目前生产和使用中普遍存在的问题和解决方法2.2.1 过去我 国很多公司生产和检验 HPLC-般都是将泵、检测器单独生产、单独自检、单独送质检部门检测。经质检部门检验后和未经检测的外购柱-起出厂。对使用者来说，等于买了3个部件，自己组装后使用。在用户那里，因为条件所限，三者联机后自然出现很多问题；其实这些问题都是应该在生产制造、检验过程中得到合理解决的，结果移转换了用户那里。由于用户那里没有条件解决这些问题，于是就将这些问题都归罪于国产 HPLC仪器的质量。

2.2.2 色谱柱是易损件，用户会经常在色谱柱长时间使用后换新柱，此时 HPLC系统的泵和检测器基本进入电子元件失效理论的盆底”2、 ，比较稳定了。因此，不会因为换新柱而产生仪器不能使用的问题。特别应该指出的是：用户换新柱后，-般不检测系统的综合指标。如果检测指标，可能就不能达到原出厂指标(因为泵和检测器经过较长期使用后，质量会有所下降，旧泵、新柱、旧检测器三者不能达到最佳配备)。用户换新柱不会影响使用的问题，可以从计量认证标准规范(JJG)得到佐证；JJG检验的仪器，很多是在用仪器，它明确规定被检仪器的指标可以比新出厂的仪器指标低，甚至有些指标因为达不到要求而免检。但我们的制造企业，在仪器出厂前，必须检测指标，只有指标达到设计要求时，才算合格，才能出厂。至于用户换新检测器、换新泵，同样都是允许的。但是，如果要求检测换新泵或新检测器后整个系统的指标，则仍然必须要配换新柱。必须是新柱 、新检测器、新泵 ，三者联机检测指标。否则，会由于系统的泵、柱、检测器因使用时间过长而指标下降，会使 HPLC系统的检测结果达不到出厂要求。此时用户会怪罪生产公司，认为是仪器不合格。

笔者认为 HPLC生产者应该采取的正确做法：泵、柱、检测器三者联起来检验，三者同时入库(编号)，三者成套出售。这样才能保证仪器在用户那里的质量 。

3 使用者应该高度重视色谱柱及柱外的有关问题3.1 色谱峰拖尾：与柱、流动相的流速、试样等有关 ，发现拖尾-定要从这些方面查找原因。

3.2 如何延长色谱柱寿命：保养很重要，长期不用时需用甲醇浸泡；严格控制洗柱时间或溶剂体积；- 般经常使用的柱，下班时应该洗 45分钟或 20倍床体积。

3.3 必须注意对柱外效应”的控制：所谓柱外效应”，就是指 HPLC系统中，除柱系统外，管路、连接件、进样器和流动池的死体积等引起的色谱峰增宽效应 。

3.4 自动进样时 ，应该经常检测 自动进样器 ，对仪器进样器要求稳定可靠，手动进样时，应该特别注意取样时的细节，进样时的手感(轻、重、缓、急)等。

4 HPLC的研发者和使用者应该特别注重对色谱柱质量的判断4.1 谱柱的柱效：塔板数高者好，特别要注意影响柱效的因素。塔板数降到-定程度该柱就报废了。

4.2 重复性：-根柱子反复使用时，最好 RSD能够保持小于 0.1 。

4.3 耐用性：因为柱效很容易降低，所以要重视对柱的保护。

4.4 色谱柱使用后-定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、阻塞、降低塔板数。-般应该用 2O倍床体积冲洗 ，隔几天再用的 HPLC，最好用 2O 甲醇 ：8O 水冲洗 3O分钟左右后，再用纯甲醇冲洗 20分钟后保存[2]。

5 HPLC的制造者和使用者应该特别重视流动相问题5.1 pH值：-般 C18柱 pH小于 3时，容易损坏色谱柱。但是抗酸性的柱可以使用小的 PH值。

5.2 注意选择试剂的截止波长 、 ：如乙腈截止波长 215nm、丙酮截止波长 330nm、正丁烷截止波长210nm等。

5.3 流速要适当，否则影响峰形、浪费溶剂，-般常规分析工作大多选择 lmL/min。

46 分 析 仪 器 2013年第3期5.4 脱气：气泡进柱会严重影响 HPLC的稳定性，有可能损坏柱子 。

6 制造者和使用者应该注重溶剂前处理 ，最好使用 HPLC级的优质溶剂。使用前必须过滤和脱气6.1 过滤 目的溶剂进泵前和样品注射前应该过滤除去溶剂中的微信粒、微生物，以保证泵和色谱柱不会堵塞或损坏。

6.2 对过滤器的要求和最佳孔径选择方法对过滤器总的要求：速度快、溶出度孝死体积孝精确的孔径、体积适当、化学兼容性好等。

最佳孔径选择方法：如果色谱柱填料直径小于3 m或除菌过滤，-般选择 0.2 m孑L径。如果色谱柱填料直径大于 5/.tm，则选 0.45/tm。如果是预过滤或过滤难过滤的样品，-般选 1 m孑L径。特别是对使用无机盐配制的缓冲液，更要注意选择合适的过滤器 。否则 ，不可能得到可靠的分析测试数据 。

6.3 脱气主要 目的是除去流 动相 中溶解或 因混 合而产生的气泡。液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。流动相的气泡进入液相泵会引起压力的上下波动 ，危害很大。必须除之∩ 以打开排空阀，大流速冲洗。

7 制造者和使用者应该注重缓冲液问题7.1 缓冲液使用前必须过滤。

7.4 梯度洗脱时，选低吸收值的缓冲液 。例如：梯度洗脱时，缓冲液与有机相应预混，以防止析盐。

在保证峰不拖尾的情况下，旧能选用低浓度的缓冲盐，防止析盐。缓冲盐浓度，-般用 2030mM就可以了，如果流动相中有机相含量高的话，流动相中的盐类缓冲液浓度就不能过高，盐的浓度起码要保证在流动相条件下不会析出。离子对缓冲液浓度要高-点 ，-般 5O～100mM。

8 检测器问题[1.2 -6]8.1 最常用的检测器有 3种(紫外 、荧光 、光蒸发散射)。紫外检测器覆盖面约 75 ，荧光检测器覆盖面约 15 ，蒸发光检测器(包括示差折光检测器)覆盖面约 5 。波长 ：固定 254或可变波长常用 ，可变波长较好。

8.4 灵敏度：应该经常检测，以保证 HPLC系统的检测限。

9 12个常见问题12个常见问题及排除方法见表 1表 1 常见问题及排除方法2013年第3期 分 析 仪 器 472.泵压力过低管道系统或柱接头部位漏液泵中存在气泡单向阀脏污泵流速设定太低检查漏液位置并鹏。

5.泵流速变小泵内有气泡溶剂过滤器堵塞泵中有两种溶液不互溶柱塞密封泄露打开放空阀，让泵在高流速下运行，排除气泡。

打开泵头人口压帽，如果溶剂不能很快流出输入管，说明过滤器堵塞，需要清洗或更换。

用-种介于两种溶剂之间的过渡溶剂 ，来溶解两互不溶解的溶剂。

48 分 析 仪 器 2013年第3期12。保留时间变化问题(分析数据重复性差)至竺 析样品时未达到平衡使保 平衡系统。 留时间变化 -室温波动大，使保留时间变化 使用柱温箱。

柱被污染使保留时间变化进样体积太大或样品浓度太高使保留时间变化流动相组份变化使保留时间变化清洗之。

10结论 蓑 蓑 辜影响 HPLC质量的因素、影响 HPLC分析误差 用水平。