甘油脱氢酶生产工艺仿真设计与技术经济分析

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甘油脱氢酶 (glycerol dehydrogenase，GDH)是 以甘油 为底物生产 二羟基丙酮 (dihydroxyace-tone，DHA)和 1，3-丙 二 醇 (1，3-propanediol，PDO)的关键酶 之-。以甘 油为底物 的微 生物典型代谢 途 径Ⅲ 如 图 1所 示 ，甘 油 经甘 油 脱 水酶(glycerol dehydratase，GDHt)催化生成 3-羟基丙醛 (3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA)，再通过1，3-丙二醇氧化还原酶 (1，3-propanediol dehydro-genase，PDOR)和 NADH 的作 用生成 PDO，同时提供甘油脱氢所需的 NAD。，通过 GDH催化生成 DHA。因此 ，制备 GDH 能 为胞外 多酶耦联 法生产 DHA和 PDO提供生物催化剂 ，同时可单独作为酶制剂出售 ，研究 GDH 的生产工艺具有重要意义。

GDH基于电子受体和反应产物不同可分为三类2 ]：(1)GDH (EC 1.1.1.6)依赖 NAD 催化转化甘油为 DHA，常见存于各种细菌中4 ； (2)GDH (EC 1.1.1.72 与 EC 1.1.1.156) 依 赖NADP 催化 转化甘油 为甘 油醛或 DHA，主要存于霉 菌 和 动 物 组 织 中5 ； (3)GDH (EC1.1.99.22)不依赖辅酶也可氧化甘油，发现存于醋酸菌和葡糖杆菌的细胞膜上4-6l。以甘油为碳源并生成 PDO的主要微生物如克雷伯杆菌属 、柠檬菌属及梭状芽孢杆 菌属等主要含有第 -类 GDH。

目前有 文献报 道 ，GDH 已经从 -个 突变 Esche-richia coli[、Klebsiella aerogenes E引、 Cellu-lomonas sp.NT3060[ 、 Bacillus megaterium[、Schizosaccharomyces pombe[ 、 Bacillus stearo-thermophilus[ 、 Citrobacter freundii[ 、 C10s-tridium butyricum E5L 、 Bacillus stearother-0philus[ 和 Klebsiela pneumoniae[ 等 细胞 中获得 纯化，其 中 Klebsiela pneumoniae属于兼性厌氧菌 ，具有甘油耐受力 ，较高 的转化率 和 PDO生产能力[16 18]，生化 特性 与大肠杆 菌接近l1 。本文小试利用基 因工程方法将 Klebsiela pneumoniae中编码 GDH 的基 因 gldA克隆到 E.coli中，构建表达 GDH的重组基因工程菌 ，通过发酵生产实现GDH的活性表达后，对其进行纯化获得高表达量 、高活性 的 GDH (相对分子质量约 16000，酶活温度 65℃，最适 pH-l1)。本文将结合小试结果，应用 SuperPro Designer###流程模拟软件仿真放大 GDH 的生产流程并进行工艺技术经济分析，为工业化应用提供设计依据 。

1 GDH 生产工艺小试从 Klebsiella pneumoniae DSM2026基 因组 DNA经 PCR扩增得到 GDH 的编码基因 gldA，插入 gldA到克隆载体 pMD-18T中构建重组克 隆载体 pMD-gldA，再进行亚克隆到表达载体 pET-32a构建重组 表达载体 pET-32gldA。重 组大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)/pET-gldA 以甘油为碳源和乳糖为诱导剂2 ，经发酵培养并细胞破碎和分离纯化获得重组 GDH。该表达产物带有His6-tagged标记 ，选用 Ni柱对表达产物进行了纯化。基于小试放大 ，设计 GDH生产工艺如图 1所示 ：第-阶段是在有氧条件下以甘油为底物 ，经重组大肠杆菌发酵生产 GDH；第二 阶段是对重组 大肠杆菌细胞进行高压匀浆破碎，破碎后通过离心分离初步去除细胞碎片等大分子物质，达到初步纯化的目的；第三阶段是对生成 的 GDH进行纯化 ，首厂 ∞上 洲 上 。-O5- - acetaeHO buyrt 厂----- --- Ho- oH二 - o--.[二二 ethan。l I / 、dihydroxyacetone l formateI Tn OH r、u I dihvdr0xvacet0nOe- lactate H0、 、/上- 0H NAD ～ n e ，l，，-rcd - succinateglyceroll ：o 弋 /HQ . o - HOw OH图 1 甘油的典型代谢途径Fig.1 Typical metabolic pathways of glycerol第 6期 曾宏等：甘油脱氢酶生产工艺仿真设计与技术经济分析 ·27·图2 甘油脱氢酶生产工艺流程Fig.2 Flowsheet of GDH production先通过亲和层析进行纯化，再通过凝胶过滤达到进- 步的纯化 ，通过渗滤去 除无 机盐达到净化 的 目的，最后通过冻干获得 GDH产品。

2 生产工艺放大仿真2.1 模拟方法SuperPro Designer###模拟软件进行工艺仿真分析的主要方法如下[2。 ： (1)设置工厂操作模式(plant operation mode)和年操作时问 (annual op-erating time)，本工艺批次操作，设定过程 Batch模式和工作时间 7920 h·a ，并根据实验或工业数据设置各装置的时序数据 (scheduling informa-tion)； (2) 注 册 过 程 组 分 数 据 ，包 括 纯 组 分(pure components)与混合物 (stock mixtures)，本工艺部分组分如 GDH未包含于数据库，须 自定义；(3)设置其他资源数据 (other resources，主要包括 heat transfer agents、labor、consumables、raw materials等)，本工艺结合实验和 国内相似企业数据及当年物价进行初始化设定；(4)建立仿真流程，选择合适单元操作模型 (unit procedures)建立流程 ，某些操作无合适模型时，通过拈组合或调整相似模型参数实现仿真；(5)计算序列和收两法，通过单元或时间序列规定计算序列；采用全流股直接迭代 收两法 ，循环物流较难收敛则相应进行预估和切断，关键过程模型根据实验或工程数据输入初始化参数或初值求解 ，再逐级进行放大计算 ；(6)成本和经济估算 (costing and economicevaluation)，归集设备、原料和类似企业 的运营成本 ，应用系数因法 (factors)进行技术经济分析。

2.2 过程放大仿真设置SuperPro Designer###仿真设计 GDH 生产 的工艺流程如 图 3所示，生产工艺主要分为 3个工段 ：发酵过程 、回收过程和纯化过程。

2.2.1 发酵工序 混合贮罐 (b1ending/storage)：物料组 分 主要基 于 小试 的种 子培 养 基 和发 酵 培养基。

高温 灭 菌 (heat sterilization)：高 压 热灭 菌(温度 121℃、时间 2030 rain)。实验过程 中先预热-段时间，至 9O℃ 以上 时，将蒸 汽直接通人培养基 以减少冷凝水量 ；灭菌结束通无菌空气 以维持罐压并开启冷凝系统进行冷却。

发酵 (fermentation)：批式流加发酵培养 ，发酵培养液经灭菌冷却后加消泡剂 ，以 10 接种量将种子培养液接种于装有发酵培养液的 2O m。发酵罐 中，装液量为 70%，控制温度 35～38℃，用氨水调节 pH，搅拌 速率 350～450 r·min-。，通气量 0.4～2.8 vvm，限制性流加氮源 。

2.2.2 回收工序 匀浆破碎 (homogenization)：高压 (80 MPa)条件下总流率约 10 m。·h 匀浆破碎操作 3次 ，每次通过匀浆机的裂解液需用冰浴· 272 · 化 工 学 报 第 64卷P.1 8/V-10storage图 3 甘油脱氢酶生产工艺全流程仿 真设计Fig.3 Complete flowsheet of process simulation design for GDH production冷却，使匀浆器出口温度不超过 40℃。

离心 (certrifugation)：l2000 r·min。、4℃下离心 15 rain，去除细胞碎片获得粗酶液。

2.2.3 纯化工序 亲 和层析 (INX ehromatogra-phy)：常规法 Ni柱亲和层析。Ni柱先用 pH 7.4的缓冲液 A (20 mmol·L 咪唑 、20 mmol·L磷酸钠 、500 mmol·L 氯化钠)平衡 ；上样后 以缓 冲液 A洗脱 杂蛋 白，再用 pH 7.4的缓冲液 B(500 mmol·L 咪 唑、2O mmol·L 磷 酸 钠、500 mmol·L 氯化钠)洗脱 目的蛋 白并收集。

凝胶过滤 (gel filtration)：先用去离子水洗柱子，把柱子中封存的乙醇洗出；用 phosphare bufer A (20 mmol·L 磷酸钠 、500 mmol·L 氯化钠 、500 mmol·L 咪 唑 ，pH7.4) 平 衡 后 用phosphare bufer B (50 mmo·L 磷 酸钠 、150mmol·L 氯化钠，pH 7.0)洗脱 ，然后 用去离子水进行平衡并用 20 乙醇封柱 。

渗滤 (diafiltration)：膜 过滤 具选择 透过 性，小分子随溶剂透过膜不断被除去 ，提高被截组分和透过组分的分离度 ，进-步纯化 GDH。

冻干 (freeze drying)：冷 冻干燥排 除 95%～99 以上的水分，GDH产品长期保存而不变质，GDH酶活测定体系2。比活力平均达 150 U·mg 。

3 仿真结果与经济分析3.1 工艺放大仿真结果3.1.1 过程物料消耗 工艺放大仿真结果按每年、每批及单位产品所需的主要原料消耗列于表 1。从表 中可见 过程用水 、Na。PO (0.02 mol·I )、NaC1(0.5 mol·L )、NaC1(0.1 mol·L ) 和C。H Nz消 耗 量 较 大。其 中 大 部 分 注 射 用 水(WFI)用于离子柱清洗 ，而上述药剂均主要 为纯化工序使用 。模拟结果 GDH 回收率约 69.92(按 发 酵 液 中 GDH l19.721 kg回收 纯 化 GDH83.71 kg)。

3.1.2 过程概要和设备利用 批次操作仿真结果的过程概要和设备利用情况分别如表 2和表 3所示 。过程时间安排很大程度上决定了分批生产方式的产能 。本工艺每批时间估算 171 h，显示从原料准备到最终产 品的时间。由于绝大多数设备利用时间远小于-批 生产时间 ，因此每 36 h左 右开始新批次。-t生产中每个设备都存在空闲时间，有些第 6期 曾宏等：甘油脱氢酶生产工艺仿真设计与技术经济分析 ·2J 73 ·表 1 主要原材料消耗Table 1 M ain bulk raw materialsNote：M P- flow of component GDH in stream product表 2 过程概要Table 2 Process summary表 3 主要设备利用情况Table 3 M ain equipment capacity utilization and uptime设备可重复利用 ，最姓闲时间的设备 (表 3显示流程中的 V-107 uptime达 95.10 )决定 时 间瓶颈 ，-般由其确定-年最大分批次数 。以 36 h为发酵周期，本工艺-年生产批数约 216批，GDH产能约达 17899 kg。

3.2 技术经济分析3.2.1 固定成本分析 固定资产成本 (fixed cap-ital cost，FC)是固定资产的各种成本总和 ，包括工厂总成本 (total plant cost，TPC)和承包商及应急费用成 本 (contractorS fee& contingency，CFC)。TPC由工厂总直接成本 (total plant directcost，TPDC)和工厂总 间接成 本 (total plant in-direct cost，TPIC)构成 。TPDC的计算基于设备价格 ，参考类似企业的设备数据，同时考虑部分设备企业 自主制造能力 ，本工艺主要设 备成本见表4，该工艺产能工厂的主要设备总成本约 959万元 。

表 4 主要设备类型和成本 (2010年估价)Table 4 Major equipment specificationand FOB cost(2010 prices).ty～ e Descriptionstan by cosut/：Y， / d- L Y /L l、固定 资本 成本估 算 。 见表 5，其 中 TPDC包括 ： (1)设备 成本 (equipment purchase cost，PC)，主要指设备销售的离岸价格 ，本文参考近年类似企业的生产数据和自制能力按设备体积和材质换算 ； (2)安 装成本 (installation)，包括人工 、安装材料和设备服务费用等 ，系数取 0.4；(3)管道系统 (process piping)，包括主体 管道和连接阀件 、支撑和基座等 ，系数取 0.35； (4)仪表控 制(instrumentation)，包括控制器、信号器、控制终端及配线等，系数取 0.4；(5)隔绝材料 (insula-tion)，包括隔热 、绝缘、防火 、防水 等材料及 附加费用 ，系数取 0.03； (6)电气 成本 (electri-· 2 74 · 化 工 学 报 第 64卷cad，包括供电、照明、电控、电力线路及应急电源等，系数取 0.1； (7)建筑成本 (buildings)，包括厂房 、仓库 、办公和生活场地等配套设施 ，系数取 1.0；(8)场地改进 (yard improvement)，包括施工挖掘、平整场地、围墙 、停车惩消防设置等 ，系数取 0.15；(9)辅助设施 (auxiliary facili-ties)，包括蒸汽动力、机械加工等配套设施 ，系数取 0.4。

TPIC的计算系数基于 TPDC，包括 ：(10)工程费用 (engineering)，即工艺研制设计 的完整过程，包括设备和仪表自动化设计及说明书、控制系统开发或软件采购、图纸准备、实验及测试等 ，基于全新工艺开发考虑 ，系数取 0.3； (11)建设施工 (construction)，相关建设组织和施工安排、进度和劳动成本等，系数取 0.4。

承包商和应急费用 (CFC)的计算基于 TPC，包括 ：(12)承包商费用 (contractorS fee)，部分项 目工程费 ，本厂承建也须考虑承建部 门利润2 ，系数取 0.05； (13)应急 费用 (contingency)，主要应对项目投资期的不确定因素、施工期的意外情况和零星项目的预留金等，系数取 0.1。根据表 5，本产 能 工 艺 总 固 定 资 产 成 本 (DFC)核 算 约6752.3万 元 。

表 5 固定资本成本估算 (2010年价格)Table 5 Fixed capital estimate summary (2010 prices)Item Cost/CNYA.total plant direct cost(TPDC)(physical cost)(1)equipment purchase cost(PC)(2)installation(0.4 PC)(3)process piping(O.35 PC)(4)instrumentation(0.4 PC)(5)insulation(0.O3 PC)(6)electrical(0.1 PC)(7)buildings(1.0 PC)(8)yard improvement(O.15 PC)(9)auxiliaryacilities(0.4 PC)TPDCB.total plant indirect cost(TPIC)(1o)engineering(0.25 TPDC)(11)construction(0.35 TPDC)TPICC.total plant cost(TPCTPDC TPIC)TPCD.contractorS fee& contingency(CFC)(12)contractorS fee(0.05 TPC)(13)contingency(0.1 TPC)CFC-(12) (13)E.direct fixed capital cost(DFCTPCCFC)DFC3.2.2 操作成本分析 工艺操作成本主要包 括原料 、耗材、能量费用、劳工、设备维护、质量控制 、表 6 年操作成 本 (2010年价格 )Table 6 Annual operating cost summary (2010 prices)㈣ ㈣瑚姗㈣ 栅 娜 ㈣麟㈣O 0 ∞∞ Ⅲ第 6期 曾宏等 ：甘油脱氢酶生产工艺仿真设计与技术经济分析环保治理、办公及广告销售等营运费用L2引。参考国内类似企业近年内的生产数据，结合小试结果放大 ，工艺过程主要操作成本核算见表 6。生产成本中耗材和原料成本 占最大份额 ，其中主要耗材成本核算见表 7，主要是亲和层析和凝胶过滤过程中消耗 ，亲和层析年花费约 1720万元 ，凝胶过滤年花费约 2023万元 ，合计近操作成本的 60 。

3.2.3 经济效益分析 该工艺每年约产 17900 kgGDH 的效益分析见表 8：生产装置 的总成本 约为7536万元 ，正 常年 销售 总收入 约为 11634万元 ，年销售所需要上缴税收约为 2108万元 ，所得年净利 润 约 3804 万 元，投 资 收 益 率 (ROI) 约5O.48 ，投资回收期 1.98年。

表 8 效益分析 (2010年估价 )Table 8 Profitability analysis(2010 prices)次操作 (batch opreration)过程模拟 ，完成对相关生产条件及参数的模拟设定并尝试过程优化，进-步通过成本 和经济估算 为可行性工业化设 计提供参考 。

(1)过程仿真结果表明 ，过程关键数据基于小试结果放大，产品符合工业酶制剂标准 ，工艺流程设计合理。

(2)该 产 能工 艺 在 亲 和层 析耗 材 年 花 费约1720万元 ，凝胶过滤耗材年花费约 2023万元 ，是操作成本的主要影响因素，所以对柱的清洗再利用可极大降低纯化工序生产成本 ，以此来提高该项 目过程的净利润以及企业应对市场变化的能力 。

(3)该工艺每年生产约 17900 kg甘油脱氢酶(GDH)，直接固定成本约 7536万元 ，正 常年销售总收入约 l1634万元 ，年缴税 约 2108万元 ，所得年 净 利 润 约 3804万 元 。投 资 收 益 率 (ROI)50.48 ，正常期的投资回收期 1.98年 ，该过程工艺具有较好可行性。

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